仙茅苷对脂多糖诱导血管平滑肌细胞增殖、迁移及表型转化的影响

贾鑫，王锋，刘宝辉，杨凯强，王玉玖，董圣军

(滨州医学院附属医院，山东 滨州 256600)

主动脉夹层(aortic dissection,AD)是主动脉壁的急性病变，伴有由于破裂或壁内血肿引起的中膜分离[1]。主动脉夹层的发病率为每年每百万人5至30例。急性主动脉夹层是一种高度致命的心血管急症，未经治疗的患者在症状发作后每小时的致死率为1%～2%[2]。越来越多的研究发现主动脉夹层等大血管疾病的发病机制与血管壁结构破坏、中层血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)大量消失及血管壁的重塑有关，而VSMCs表型转化和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)降解是导致这一病理过程的重要因素[3]。因此，深入了解VSMCs表型转化的发病机制，寻找更有效、更安全的干预目标，对AD的防治具有重要的临床价值和社会意义。仙茅属植物为仙茅科天门冬目，其中仙茅苷(curculigoside，Cur)是仙茅的主要活性成分。目前已有研究发现仙茅苷对心血管系统有明显的保护作用[4-5]。但其在血管平滑肌细胞中的影响和机制方面的研究相对较少。

此次研究使用体外方式进行实验，先对大鼠的胸主动脉的平滑肌细胞进行培养，将其通过脂多糖诱导血管平滑肌细胞表型转化，探讨仙茅苷对主动脉血管平滑肌细胞增殖、迁移及表型转化的作用及其机制。旨在为仙茅苷临床用于主动脉夹层的治疗提供理论依据和新方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物 从济南朋月实验动物繁育有限公司购买30只无特定病原体的雄性SD大鼠(体质量180～210 g)。许可证号：SYXK(鲁)20190003。所有大鼠在滨州医学院附属医院动物房内饲养和训练，许可证号：SYXK(鲁)20180022。饲养期间所有大鼠自由饮食，室内温度20～25 ℃，湿度45%～55%。

1.2 试剂与仪器 噻唑蓝(MTT，北京索莱宝公司)；仙茅苷标准品(上海鼎瑞化工有限公司)。兔源抗大鼠MMP-9、α-SMA、NF-κB和β-actin 抗体(美国Abcam公司)；羊抗鼠IgG(美国Abcam公司)；细胞裂解蛋白提取液、BCA试剂盒以及蛋白酶抑制剂(上海碧云天生物公司)；CO2细胞培养箱(美国Biopac公司)；电泳、湿转移槽以及Western blot发光照相系统(美国Rio-Red公司)；酶标仪(美国Biotech公司)；生物显微镜(日本Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 血管平滑肌细胞培养 将实验所需大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞通过组织贴块法进行培养[6]。实验大鼠处死后将其胸主动脉小心取出并除去其外周残存的结缔组织，然后将其剪成1 mm大小的组织块，转移到培养瓶中，将培养瓶轻轻翻转，使其瓶底向上，在其中添加细胞培养基5 mL，置于培养箱中，在30 ℃ 5% CO2条件下进行3 h孵育处理，在培养瓶中组织块完全与培养瓶底贴附后，将培养瓶缓慢翻转，以保证其中组织块能够被培养基完全覆盖，培养7 d后将培养瓶取出更换其中的培养基，对VSMCs的繁殖情况进行观察，然后每隔一天对培养基进行更换到细胞完全融合成片为止。

1.3.2 细胞分组及处理 原代VSMCs传代培养4-6代，倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长现象，当细胞密度>90%，且形态良好时则可进行分组干预：①对照(control)组：DMSO 溶剂对照组(0.1%)培养24 h；②脂多糖(LPS)组：给予1 μg·mL-1LPS培养24 h；③脂多糖+仙茅苷(LPS+Cur)组：加入Cur(2.5、5、10 μmol·L-1)0.5 h后再加入1 μg·mL-1LPS培养24 h；④Cur组：加入10 μmol·L-1的Cur进行干预后培养24 h。

1.3.3 MTT法检测细胞增殖率 将各组VSMCs通过添加10%胎牛血清的培养液进行处理，得到相应的单个细胞悬液，然后按照每孔1 000～10 000个细胞的接种量，200 μL/孔的标准将其加入96孔板中，然后进行相应干预，每组设置6个复孔，接种完成后，将其置于环境为37 ℃、5% CO2的培养箱内进行48 h的细胞培养，之后取出96孔板，弃去其中剩余培养液，按照每孔20 μL向其中添加5 mg·mL-1的MTT溶液。继续培养4 h，然后将孔内剩余的培养上清液小心清除。按照每孔150 μL的要求向其中添加DMSO，然后振荡10 min，确保其中的结晶物能够完全融解。将所得液体置于酶联免疫检测仪中，在490 nm波长下检测并记录各孔的光吸收值，然后根据所得结果绘制横纵坐标分别为时间和吸光值的细胞生长曲线。重复进行3次。增殖抑制率=(对照组OD值-各组实验组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。

1.3.4 细胞划痕实验检测细胞迁移率 详细实验操作基于相关参考文献确定[7]。传代处理血管平滑肌细胞后，按照5×105的规格将其接种到6孔板中，对其进行相应处理后，通过洁净枪头在板表面垂直划平行的3条划痕。以此计时为0 h，拍照后将培养板放入培养箱内继续培养24 h取出拍照，根据划痕宽度变化计算划痕愈合率。划痕愈合率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。实验重复3次，取平均值。

1.3.5 通过Western blot法对细胞中MMP-9、α-SMA以及NF-κB蛋白的表达情况进行检验 各组细胞经上述干预因素处理48 h后提取细胞蛋白，并根据BCA法所测蛋白浓度调整加入各组蛋白样品的体积，保证各组蛋白上样样品质量一致。依次通过电泳、转膜、封闭，滴加一抗α-SMA、MMP-9、NF-κB(1∶1 000稀释)4℃过夜，洗膜、孵育对应二抗、再次洗膜后用现配发光液进行曝光显影，Bio-Rad照相系统进行照相并分析蛋白的相对表达量。

1.4 统计学分析 将所得实验数据通过SPSS 20.0软件进行处理分析，所得结果均通过加减标准差的形式进行表示，在比较不同组情况时，将两两间的比较t检验进行验证，多组间的比较通过One-way ANOVA方法进行验证，若检验结果显示P<0.05，则组间差异显著，存在统计价值。

2 结果

2.1 仙茅苷影响血管平滑肌细胞增殖率的情况 根据MTT比色法对其进行处理，发现LPS组相较于控制组而言，在给予细胞LPS处理后，其OD值出现明显提高(P<0.001)；而比较LPS组细胞OD值和LPS+Cur组细胞OD值，发现后者的OD值显著下降(P<0.01)；Cur组细胞增殖率与对照组相比无统计学差异。表明LPS预处理血管平滑肌细胞可明显增加血管平滑肌细胞增殖，而仙茅苷可明显抑制脂多糖对血管平滑肌细胞的增殖作用(见表1)。

表1 仙茅苷对血管平滑肌细胞增殖率的影响

2.2 仙茅苷对血管平滑肌细胞迁移率的影响 与对照组相比，LPS诱导的主动脉血管平滑肌细胞迁移率升高(P<0.001)；而与LPS组相比，LPS+Cur组主动脉血管平滑肌细胞迁移率降低(P<0.01)；Cur组与对照组相比细胞迁移率无明显统计学差异。表明给予大鼠主动脉血管平滑肌细胞仙茅苷能够抑制因LPS刺激引起的细胞迁移(见表2)。

表2 仙茅苷对血管平滑肌细胞迁移率的影响

2.3 仙茅苷对血管平滑肌细胞相关蛋白表达水平的影响 与对照组相比，LPS组细胞内MMP-9及NF-κB蛋白表达量明显增加，而α-SMA蛋白表达量显著减少(P<0.01)；LPS+Cur组细胞内MMP-9及NF-κB蛋白表达量与LPS组相比减少明显，α-SMA蛋白表达量显著增加(P<0.05)；Cur组与对照组相比无明显统计学差异。表明仙茅苷可抑制脂多糖诱导的血管平滑肌细胞表型转，且其机制可能与NF-κB信号通路有关(见图1)。

图1 仙茅苷对血管平滑肌细胞α-SMA、MMP-9以及NF-κB蛋白表达水平的影响

3 讨论

主动脉夹层(AD)是常见的危及生命的疾病。由诸如马凡综合症状基因突变引起的AD被称为可遗传的AD，自发发生而没有已知基因突变的AD被称为散发的AD，并且与高龄、性别、吸烟、高血压和血脂异常等危险因素相关[8]。遗传性和散发性AD具有以下共同的组织学特征:血管平滑肌细胞表型转化、弹性纤维破坏和损耗及炎性细胞浸润等，以上因素导致主动脉壁弱化、主动脉扩张、剥离和最终破裂[1]。其中主动脉壁中层血管平滑肌细胞表型转化在AD发生发展过程中起到重要的作用。

血管平滑肌细胞(VSMCs)是动脉中层的基本组成部分，对动脉生理和病理学至关重要。血管平滑肌细胞和其他处于终末分化期的细胞不同，其表现出十分有效的可塑性。当机体处于健康状态时不会使得血管平滑肌细胞受到刺激，其不会出现大量的迁移或者增殖并且细胞保有较强的收缩能力，在这一状态下其会表达包括平滑肌α肌动蛋白(α-SMA)以及平滑肌22α蛋白(SM22α)等具有特定功能的收缩蛋白和细胞骨架蛋白以维持细胞正常形态功能。但是若改变细胞所处环境，将可能对血管平滑肌细胞产生刺激，血管平滑肌细胞转化成去分泌表型细胞，此状态下细胞的收缩能力会大大降低，并且表现出较强的迁移和增殖能力，并表达基质金属蛋白酶9(MMP-9)等特异性标志物[9-10]。因此抑制VSMCs的表型转化及其所致的异常增殖与迁移对于防治AD等血管相关疾病具有重要意义。

仙茅是石蒜科多年生草本植物，富含多糖、皂苷、酚类、酚苷、萜类等多种重要的生物活性物质。仙茅苷是仙茅的主要活性化合物，其具有抗氧化、抗抑郁、防止骨质疏松等多种药理作用[5]。近年来Cur在心血管领域研究逐渐成为热点，尤其对心肌细胞、血管内皮细胞均有保护作用[11-12]，而其在血管平滑肌细胞表型转化中的作用尚未见报道，仍需进一步研究。

本研究结果显示,脂多糖作用于VSMCs后,可显著增加VSMCs增殖率、迁移率及MMP-9的蛋白表达量，降低细胞内α-SMA蛋白表达量；进一步提示脂多糖可诱导血管平滑肌细胞从收缩表型向合成表型转化，进而导致增殖率、迁移率明显升高。而与LPS组相比,LPS+Cur组血管平滑肌细胞的增殖率、迁移率以及MMP-9的蛋白表达量明显减低，细胞内α-SMA蛋白表达量明显升高，进一步提示仙茅苷可抑制由脂多糖诱导血管平滑肌细胞增殖、迁移及细胞表型转化的改变。而在进一步研究我们发现，与对照组相比，LPS组细胞内NF-κB蛋白表达量明显升高；而LPS+Cur组血管平滑肌细胞内NF-κB蛋白表达量显著降低于LPS组。表明仙茅苷可抑制由脂多糖诱导的血管平滑肌细胞NF-κB蛋白表达升高。因此，仙茅苷在逆转VSMCs由收缩表型向合成表型转化的过程可能是通过抑制NF-κB分子以及其介导的相关信号通路实现的。

综上所述，本研究发现仙茅苷可明显抑制由脂多糖诱导的血管平滑肌细胞表型自收缩表型向合成表型转化，进而抑制血管平滑肌细胞的增殖率与迁移率，其作用机制可能通过抑制NF-κB信号通路实现，或可为临床治疗主动脉夹层等心血管疾病提供理论基础。本研究局限性在于仅初步探讨仙茅苷抑制血管平滑肌细胞表型转化的分子机制，其对于主动脉夹层等心血管疾病的防治作用还待进一步研究。