苗会娟,徐艳梅,王春霞,盖 成,高燕霞
(河北省药品医疗器械检验研究院·国家药品监督管理局仿制药质量控制与评价重点实验室,河北 石家庄 050200)
复方鱼肝油氧化锌软膏又名复方氧化锌鱼肝油软膏,为皮肤科非处方药。其是由鱼肝油、呋喃西林、氧化锌、石蜡等制成的复方脂溶性软膏,主要用于治疗急慢性皮炎、冻疮、轻度烧伤等[1-4]。呋喃西林属防腐消毒药,对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及大肠杆菌等有较好抗菌作用[5]。复方鱼肝油氧化锌软膏现行质量标准收载于《国家药品标准·化学药品地方标准上升国家标准(第六册)》[WS1-43(B)-89],其中缺少呋喃西林含量控制项,给药品质量控制、市场监管、医院和患者用药产生了不可预知的影响。为保证用药安全,本研究中建立了测定呋喃西林含量的高效液相色谱(HPLC)法,并按人用药物注册技术要求国际协调会(ICH)标准[6]进行验证,旨在为复方鱼肝油氧化锌软膏的质量控制和监督提供参考。现报道如下。
Thermo U3000型高效液相色谱仪,包括DAD检测器(美国Thermo Fisher公司);XS105型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司,精度为十万分之一);PB-20型pH计(德国Sartorius公司,精度为0.01 pH);Memmert D91126型恒温水浴振荡器(德国Memert公司,准确度为0.1℃)。
复方鱼肝油氧化锌软膏(天津市金耀药业有限公司,批号分别为19030401,19030402,19030403,规格为每1 g中含呋喃西林1 mg);呋喃西林对照品(中国食品药品检定研究院,批号为101167-201001,含量99.4%)。三乙胺、乙腈均为色谱纯,冰醋酸为优级纯,水为纯化水。
色谱柱:Welch Xltimate C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:0.2%三乙胺溶液(冰醋酸调pH至4.0)-乙腈(80∶20,V/V),检测波长:375 nm,柱温:30℃;进样量:20 μL[7]。
取呋喃西林对照品约10 mg,精密称定,置100 mL容量瓶中,加N,N-二甲基甲酰胺1 mL使溶解并定容,摇匀,精密量取5 mL,置50 mL容量瓶中,加水定容,摇匀,即得呋喃西林质量浓度约为10 μg/mL的对照品溶液。取样品约1 g,精密称定,置100 mL锥形瓶中,加水适量,置80℃水浴中剧烈振摇15 min使溶解,冷却至室温,全部转移至100 mL容量瓶中,用水定容,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液。按复方鱼肝油氧化锌软膏处方工艺制备缺呋喃西林的阴性样品,再按供试品溶液制备方法制备,即得阴性对照品溶液。
系统适用性试验及专属性考察:精密吸取2.2项下3种溶液各20 μL,按2.1项下色谱条件进样测定,记录色谱峰,详见图1。可见,阴性对照无干扰,理论板数按呋喃西林峰计均大于3 000,分离度均大于1.5,基线分离良好。
图1 高效液相色谱图1.NitrofurazoneA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms
线性关系考察:取呋喃西林对照品约10.60 mg,精密称定,按2.2项下方法制备质量浓度为106.00 μg/mL的对照品贮备液,用水逐级稀释,得呋喃西林质量浓度分别为0.50,1.06,4.24,10.60,50.30,106.00 μg/mL的系列对照品溶液。按2.1项下色谱条件进样测定,以对照品溶液质量浓度(X,μg/mL)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归,得回归方程Y=0.837 5X-0.756 5(r=0.998 7,n=6)。结果表明,呋喃西林质量浓度在0.50~106.00 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。
定量限及检测限考察:往阴性样品中添加对照品溶液,作为检测供试品,按2.2项下方法制备供试品溶液,注入液相色谱仪,计算信噪比(S/N),分别以S/N为3和10时的质量浓度作为检测限及定量限。结果检测限为0.1 μg/mL,定量限为0.3 μg/mL。
精密度试验:取2.2项下对照品溶液,按2.1项下色谱条件连续进样测定6次,记录峰面积。结果的RSD为0.48%(n=6),表明仪器精密度良好。
稳定性试验:取2.2项下供试品溶液(批号为19030403)适量,分别于室温下放置0,2,4,8,12,22,24 h后,按2.1项下色谱条件进样测定,记录峰面积。结果的RSD为1.21%(n=7),表明室温下供试品溶液放置24 h内基本稳定。
重复性试验:取样品(批号为19030403)适量,按2.2项下方法平行制备供试品溶液6份,再按2.1项下色谱条件连续测定6次,记录峰面积并计算含量。结果平均含量的RSD为0.96%(n=6),表明方法重复性良好。
加样回收试验:称取已知含量样品(批号为19030403,呋喃西林含量为0.90 mg/g)6份,精密称定,置具塞锥形瓶中,分别精密加入呋喃西林对照品溶液(106.0 μg/mL)8 mL混匀,按2.2项下方法制备供试品溶液,再按2.1项下色谱条件进样测定,记录峰面积,并计算加样回收率。结果见表1。
表1 加样回收试验结果(n=6)Tab.1 Results of the recovery test(n=6)
取3批样品(批号分别为19030401,19030402,19030403)内容物,按2.2项下方法制备供试品溶液,再按2.1项下色谱条件进样测定,记录峰面积,并计算样品含量。结果3批样品中呋喃西林含量分别为86.34,89.62,84.67 mg/g,平均86.88 mg/g。
预试验中,对对照品溶液和供试品溶液进行了全波长扫描,结果最大波长为375 nm,峰纯度大于99%。取供试品溶液,按2.1项下色谱条件进样,考察不同色谱柱[Agilent ZORABAX C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Waters XBridge C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)及Welch Xltimate C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)],以不同液相色谱仪(日本Shimadzu LC-20A型、美国Agilent 1260型及美国Thermo Fisher U3000型)测定,结果均能满足系统适用性要求。流动相先后考察了乙腈-30 mmoL/L磷酸氢二钠溶液(含0.1%三乙胺,50%磷酸调pH为3.0)(18∶82,V/V)[8],甲醇-水(60∶40,V/V)[9]、甲醇-0.05 mol/L磷酸氢二钠(pH 7.0,30∶70,V/V)[10]、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢铵(pH 4.5,20∶80,V/V)[11]及0.2%三乙胺溶液(冰醋酸调pH至4.0)-乙腈(80∶20,V/V),发现加入三乙胺可减少呋喃西林色谱峰的拖尾,改善峰形,且该pH为4.0的条件下,与相邻峰的分离度最好,且不含无机盐,配制简单,因此,选定0.2%三乙胺溶液(冰醋酸调pH至4.0)-乙腈(80∶20,V/V)作为流动相。
复方鱼肝油氧化锌软膏为多组分化学药,基质为无水羊毛脂和凡士林,为脂溶性基质,因此呋喃西林的提取要综合考虑基质和其本身溶解性。呋喃西林在乙醇中微溶,在水中极微溶解,而无水羊毛脂和凡士林难溶于水和乙醇。根据这一差异,考察了乙醇、水作为提取的效果,结果显示,两者的测定结果和回收率基本一致。综合考虑环保和经济性等因素,选用水作为提取溶剂,同时依据正交试验原理[12-15],考察了水浴温度、提取时间和锥形瓶体积等因素对提取结果的影响,结果显示,置100 mL锥形瓶中,80℃水浴加热15 min的条件最佳。综上所述,本研究中建立的方法分离效果和重复性均良好,测定结果准确,回收率高,可用于复方鱼肝油氧化锌软膏中呋喃西林的含量测定。