rpl32-trnL片段在柳穿鱼不同地理居群遗传多样性分析中的应用

张玉洁 石鹏霞 赵 凡 陈晓丹 孙 坤 张 辉

（西北师范大学生命科学学院，兰州 730070）

遗传多样性是生物多样性的基础和核心，一个物种的稳定性和进化潜力依赖其遗传多样性，而不同物种的经济和生态价值也依赖其特有的基因组成，因此保护物种遗传多样性具有重要意义。叶绿体DNA（cpDNA）依赖单亲遗传，具有分子量小、拷贝数多及结构简单等特点，常用于遗传多样性分析。cpDNA 非编码区相较于编码区在碱基插入/缺失（InDel）及替换等突变上都表现出了更快的进化速率，经常用于比较低级分类阶元和新近分化类群的研究。孙坤等对柳穿鱼（）cpDNA 的非编码片段32-L、Q-5’16、T-L 和S-G 进行研究，发现32-L 片段蕴含丰富的变异位点，且在柳穿鱼居群间分化明显，可作为进一步研究柳穿鱼群体遗传学的理想分子标记。

柳穿鱼是玄参科（Scrophulariaceae）柳穿鱼属（）多年生草本植物，广泛分布于我国北方地区，生于沙质地、草原、干山坡和山沟路旁等处；具有自交不亲和特性，为虫媒异交。柳穿鱼不仅用作园林花卉，还是一种常见蒙药，地上部分入药，有清热解毒、散瘀消肿之效；此外，柳穿鱼中提取的黄酮类化合物对高脂血症和肝脏脂肪变性具有保护作用，可抑制多种肿瘤细胞生长，柳穿鱼酸及其衍生物具有显著的预防过敏活性。目前，国内外关于柳穿鱼的研究主要集中在其栽培技术、生理生态以及活性成分等方面，但其居群遗传多样性的研究鲜见报道。Gabriel 等利用等位酶研究了柳穿鱼属5个自交不亲和种与3个自交亲和种的遗传多样性，发现自交不亲和种相对于自交亲和种保持了更高的居群遗传多样性，居群间遗传多样性和居群分化程度更低；陈晓丹利用RAPD 对中国柳穿鱼自然居群遗传多样性分析发现柳穿鱼自然居群内存在较高的遗传多样性，居群间存在频繁的基因交流和多次融合事件。

鉴于此，本研究利用cpDNA 的32-L 序列对柳穿鱼4个地理居群的遗传多样性指数、单倍型网络关系、遗传分化及基因流水平等方面进行深入分析，探讨柳穿鱼繁殖策略及地理隔离等因素对其居群遗传多样性影响，为柳穿鱼种质资源的合理开发利用及多样性保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料采集

试验材料分别采自河北龙头山查字林场、河北围场、宁夏银川及甘肃合水，每个自然居群选取13～17 个个体，个体间距超过3 m，共采集样本62株（以单株采集），将样本放入装有变色硅胶的自封袋干燥保存。本研究采集的柳穿鱼野生居群分布信息详见表1。

表1 柳穿鱼野生居群采样分布数据Table 1 Distribution data of wild population of L.vulgaris

1.2 试验方法

采用改良的CTAB 法提取柳穿鱼基因组DNA，将 提 取出的DNA 溶于1×TE 缓冲液置于-20 ℃储存备用。PCR扩增cpDNA的32-L片段，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，通用引物F（5′-CTGCTTCCTAAGAGCAGCGT-3′）和R（5′-CAGTTCCAAAAAAACGTACTTC-3′）。PCR 反应总体系为25.00 μL，其中无菌双蒸水12.50 μL、10×buffer 2.50 μL、MgCl3.00 μL、dNTP 3.00 μL、酶（5 U）0.75 μL、上 下 游 引 物 各1.00 μL 及DNA 模 板1.25 μL。PCR 反 应 程 序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环后72 ℃延伸10 min。扩增产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳、EB分离染色，并用Bio-Rad图形分析仪进行观察和记录，产物由上海生工生物工程技术服务有限公司进行直接双向测序。

测序结果用Chromas 2.6.6 软件读取序列，人工校对去除两端峰图信号杂乱的低质量碱基。使用DNAstar 7.0 软件中的Megalian 程序进行序列比对，以获得最终序列比对结果。柳穿鱼4个地理居群遗传多样性高低利用DnaSP 6.12软件统计可变位点（variable sites）、简约信息位点（parsimony informative sites）和插入-缺失位点（InDel）、单倍型多样性（）、核苷酸多样性（）和核苷酸平均多样性（）等参数进行描述；计算Tajima’s和Fu and Li’s值检验居群进化过程是否符合中性进化理论。柳穿鱼各居群单倍型使用MEGA 7.0基于最大似然法（Maximum likelihood，ML）构建系统发育树；利用NETWORK 5.0基于Median-joining 法对所有个体构建单倍型网络关系。进一步用GenAIEx 6.503检验各居群间遗传分化与地理距离的相关 性，ARLEQUIN 3.5进行 分子变异 分 析（analysis of molecular variance，AMOVA），探究地理因素对柳穿鱼4个地理居群的遗传多样性的影响。

2 结果与分析

2.1 柳穿鱼rpl32-trnL序列差异及多态性2.1.1 序列变异分析

柳穿鱼32-L 片段序列长度为857 bp，4个地理居群的62 个个体共检测到保守位点751个、变异位点76 个，其中插入-缺失位点55 个，单一变异位点（singleton variable sites）11 个，分别为23、68、70、73、74、75、370、378、411、509 和684 碱基位点；简约信息位点10 个，分别是125、142、254、329、537、548、606、626、646和667碱基位点。

通过对柳穿鱼4 个居群、62 个个体的分析，共获得15 种单倍型，其中只有CZ 和WC 共享两个单倍型，分别是Hap_2 和Hap_7。单倍型Hap_3、Hap_4、Hap_5、Hap_6 和Hap_8 为CZ 居群特有，Hap_13为WC特有，Hap_1、Hap_14和Hap_15为YC特有，Hap_9、Hap_10、Hap_11和Hap_12为HS特有。YC居群的优势单倍型为Hap_14，HS居群的优势单倍型为Hap_10，WC 居群的优势单倍型是Hap_13，CZ居群单倍型最丰富，但没有明显的优势单倍型（见图1），不同居群各单倍型具体分布数量见表2。

表2 柳穿鱼4个不同地理居群的单倍型分布、遗传多样性及中性检验Table 2 Haplotypes distribution，genetic diversity and neutrality test from four geographic populations of L.vulgaris

图1 柳穿鱼4个居群的单倍型地理分布Fig.1 Haplotype geographical distribution from four populations of L.vulgaris

柳穿鱼4个地理居群、62个个体的总单倍型多样性（）为0.878，核苷酸多样性（）为0.003 88，核苷酸平均多样性（）为2.994（表2）。其中，CZ居群、和最高，分别为0.838、0.003 37 和2.603。柳穿鱼4 个地理居群分布于我国西北（XB）和华北两地（HB），其中西北居群总遗传多样性水平更高，分别是0.872（）、0.003 47（）和2.808（）；4个居群Tajima’s检验均为负值，但均不显著（＞0.05），表明柳穿鱼居群的进化基本符合中性进化理论；Fu and Li’s检验中只有HS 显著性检验结果显著；XB 和HB 的Tajima’s和Fu and Li’s检验均为负值，同样也不显著（＞0.05）（见表2）。

2.2 柳穿鱼单倍型网络关系

以柳穿鱼属物种的紫花个体序列Lb/Purple 和黄花个体序列Lb/Yellow 作为外类群，采用Maximum Likelihood 方法构建柳穿鱼的单倍型系统进化树，结果显示西北居群和华北居群单倍型各自聚为一支（见图2）。其中，西北YC 和HS居群的单倍型分别聚在一起，HS居群单倍型相比于YC居群更为古老；华北CZ和WC居群单倍型交叉在一起，没有明显的居群特征（见图2）。同时，基于Median-joining 法对柳穿鱼的15 种单倍型构建了网络关系，发现15 种单倍型间的突变联系在1～5 个突变之间，Hap_10 和Hap_13 之间存在1个突变，其与Hap_14之间存在3个突变；CZ 和WC居群的单倍型间联系较紧密，YC 居群的3 个单倍型较其他居群分化明显；HS 居群的其余3 个单倍型均与Hap_10 产生突变联系，其中Hap_11 差异最大（见图3）。

图2 基于最大似然法（ML）构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of haplotypes based on Maximum likelihood

图3 基于Median-joining法构建的单倍型网络YC.○；HS.●；CZ.；WC.；+代表一个突变联系Fig.3 Haplotype network relationships constructed by Median-joining methodYC.○；HS.●；CZ.；WC.；+stands for a mutation

2.3 柳穿鱼不同地理居群间的遗传分化和基因流

遗传分化指数（）在一定程度上反映了不同居群间遗传关系的远近；取值0～1，其大于0.25时表明居群间遗传分化很大，而基因流（）的基本作用是削弱居群间的遗传分化。柳穿鱼4个地理居群总遗传分化为0.654，基因流为0.13；XB 和HB 居群间遗传分化为0.466，基因流为0.29（见表3）。各居群间遗传分化在0.067～0.842，基因流在0.05～3.46（见表3）。其中，CZ 和WC 间的基因流最大，遗传分化最小，两居群基因交流频繁。在地理距离上YC 与HS 间的地理距离要远小于CZ、WC和HS，但YC与HS间的遗传分化要大于CZ、WC 和HS，而基因流更小。应用Mantel分析检验各居群遗传分化程度与地理距离的相关性（见图4）结果表明，各地理居群的遗传分化（）与地理距离之间存在中等程度相关性但不显著（=0.36，＞0.05）。

图4 柳穿鱼各居群地理距离与遗传分化之间的Mantel相关性Fig.4 Mantel correlation analysis between geographic distance and genetic differentiation in different populations of L.vulgaris

表3 柳穿鱼四个不同地理居群之间的遗传分化和基因流Table 3 Genetic differentiation and gene flow among fourgeographic populations of L.vulgaris

2.4 柳穿鱼不同地理居群的分子变异分析（AMOVA）

柳穿鱼不同地理居群遗传变异的分子变异分析（AMOVA）结果见表4。不同地理居群间的遗传变异大（=0.654），发生在西北和华北居群间的遗传变异仅占3.15%，而发生在组内居群间的遗传变异占45.37%，各居群内的遗传变异占51.49%，说明柳穿鱼各地理居群的遗传变异主要来自于居群内部。

表4 柳穿鱼不同地理居群遗传变异的AMOVA分析Table 4 AMOVA analysis of genetic variation in different geographical populations of L.vulgaris

3 讨论

3.1 柳穿鱼居群遗传多样性

从4 个叶绿体序列中筛选出的32-L 片段蕴含丰富的信息位点，可用于分析柳穿鱼自然居群的遗传多样性，以期为柳穿鱼的资源开发利用和多样性保护奠定基础。本研究32-L 片段共检测到76 个变异位点，其中插入缺失位点占总变异的72.37%，表明插入缺失是柳穿鱼变异位点出现的主要来源。柳穿鱼4 个地理居群共获得15种单倍型，数据分析表现出较高的总遗传多样性（=0.878，=0.003 88，=2.994），这与陈晓丹利用RAPD 对柳穿鱼遗传多样性研究的结果一致。柳穿鱼居群单倍型多样性为0.878，高于天目地黄（，=0.678）、裂叶地黄（，=0.807）和 湖 北 地 黄（，=0.569）等玄参科植物。植物的遗传多样性受多种因素影响，其中繁育系统直接影响种内遗传变异量，是决定居群遗传多样性的最主要因素。Mateu-Andrés等和Torres 等利用等位酶研究了部分金鱼草属（）植物的遗传多样性，通过分析发现不同繁育系统的物种总遗传多样性（本研究我们以单倍型多样性、核苷酸多样性来描述物种的遗传多样性）表现为自交不亲和种（0.239）＞部分自交亲和种（0.175）＞自交亲和种（0.050），柳穿鱼属植物表现出同样的趋势（见表5）。除了等位酶，同工酶和RAPD 也是植物遗传多样性研究中常用的分子标记，这两种分子标记在柳穿鱼属及其近缘金鱼草属的遗传多样性分析中显示出与等位酶一致的研究结果（见表5）。自交亲和物种依赖近交，居群间基因流动较小使得各居群间存在较大的遗传变异；自交不亲和物种繁殖依赖异交，各居群间基因交流频繁，后代中有相当比例的杂合体使居群内保持高的遗传变异，因此其遗传多样性维持在较高水平。此外，Brown 和Hamrick 等认为广布、异交以及动物传播种子均会使物种具有较高的遗传多样性，故推测本研究柳穿鱼具有高遗传多样性的原因可能是以下几方面导致的。首先，柳穿鱼为玄参科柳穿鱼属植物，在我国北方地区分布广泛，生境类型多样，是居群遗传变异丰富的原因之一；其次，柳穿鱼严格自交不亲和，异交主要以鞘翅目（Coleoptera）的象鼻虫（）作为其传粉者，异交的交配系统以及动物传粉的方式均使得柳穿鱼居群出现高遗传多样性。

表5 柳穿鱼属及金鱼草属部分物种遗传多样性与其繁育系统的关系比较Table 5 The relationship between genetic diversity and breeding system of some species from Linaria and Antirrhinum

3.2 柳穿鱼居群遗传结构

AMOVA 分子变异结果表明，柳穿鱼居群内的遗传变异占51.49%，组内居群间的遗传变异占45.37%，揭示了居群内的遗传变异是柳穿鱼遗传变异的主要来源。推测其原因一是柳穿鱼专性异交，符合自交不亲和物种遗传变异分布规律，其遗传变异主要存在于居群内部；二是华北CZ 和WC 居群间地理距离近（30.35 km），加之虫媒传粉的繁殖方式，两居群间存在频繁的基因交流（=3.46），因此组内居群间的遗传变异相对较高。繁殖方式与遗传变异分布之间的密切联系，在其近缘金鱼草属多个自交不亲和物种的遗传变异分布特征中也得到印证。

植物居群的遗传结构受遗传分化和基因流的影响，遗传分化指数（）可用来反映群体进化历史，其大小可在一定程度上揭示居群间基因流和遗传漂变的程度。地理隔离是植物居群间基因交流的天然屏障。本研究柳穿鱼自然居群间的遗传分化为0.654 47，表明居群间存在大的遗传分化；4 个地理居群分布于我国西北和华北，两地居群间遗传分化系数为0.466 14。物种的遗传分化程度会随地理距离的增加而增加，地理隔离阻碍了花粉和种子传播，各居群间基因交流受到影响，从而在长期进化过程中加剧了居群间的遗传分化。Jiménez 等采用RAPD 揭示出金鱼草属（）的4 个居群随地理距离增加遗传分化程度在0.642 31～0.910 61。本研究柳穿鱼两两居群间遗传分化程度在0.067 41～0.841 85，基本表现为随地理距离增加而增加。但在地理距离与遗传分化的相关性上，不同物种的研究结果并不一致。Mateu-Andrés 等对金鱼草属7个物种共49个居群的Mantel相关性分析显示出各物种内居群间的遗传分化程度与地理距离相关性程度不一致（=0.004～0.760）但均不显著。在本研究中，Mantel检验显示柳穿鱼4个居群的遗传分化与地理距离存在中等程度相关性但相关性不显著（=0.36，=0.09），可能是HS 和YC 居群间大的遗传分化造成的。HS与YC居群间遗传分化高于HS和CZ、WC 居群间的遗传分化，推测是由于地理隔离导致居群间无法进行基因交流，且在长期进化过程中YC 居群受遗传漂变影响而HS 居群经历过居群瓶颈，使两居群间出现了大的遗传分化。

3.3 柳穿鱼的居群动态

柳穿鱼4 个居群的基因流分析结果显示除CZ和WC居群间存在频繁的基因交流外，其余居群间基因交流水平均较低。中性检验结果表明4 个居群Tajima’均不显著（＞0.05）；Fu and Li’s检验CZ、WC 和YC 居群均不显著，但HS 居群为显著的负值（-2.450 49，＜0.05），表明除HS 居群外的其他居群进化过程符合中性进化理论。中性检验显示HS 居群近期可能经历过瓶颈后的扩张，单倍型网络关系和系统发育树结果也支持这一假设，HS居群单倍型呈星状散射分布，其中单倍型Hap_9较为古老但优势单倍型为较近期的Hap_10，推测这与HS 居群生长环境相关。该居群分布在公园路旁，极易受到人为干扰引起的瓶颈事件，偶然因素的出现可能会使居群个体数量急剧减少，随着生态恢复居群大小也恢复到原来的水平，但在经历瓶颈期间，使得居群某些稀有基因以高频率存在，改变居群的遗传结构和多样性水平，一般会导致居群遗传多样性降低。居群越小，由于遗传漂变的影响，稀有等位基因越容易丢失，从而降低居群遗传多样性，这种影响在自交不亲和物种中更为明显。

综上，柳穿鱼的繁殖策略、地理隔离以及生境干扰等因素塑造了分布于我国北方地区中国柳穿鱼居群遗传多样性和遗传结构特征。本研究揭示出柳穿鱼繁育系统使得居群内具有较高的遗传多样性，在柳穿鱼资源保护方面应在居群内尽可能增加样本大小而不同居群应保持较远的距离。