超声波-复合酶法制备玉米秸秆低聚木糖工艺优化*

宋 娜，李竹生，张艳丽

（郑州职业技术学院 生物标志物定量检测河南省工程实验室，郑州 450121）

低聚木糖亦称木寡糖（xylooligosaccharide，简称XOS)，由2～7个D-木糖以β-1,4-糖苷键连接而成的功能性聚合糖[1]。低聚木糖具有优异生物学特性[2]，如增殖双歧杆菌的能力，不被消化、预防龋齿，促进人体钙吸收等，被广泛地应用于食品、药品和化妆品等工业中。

我国是一个农业大国，以玉米秸秆为代表的农林生物质原料来源广泛、价格低廉，在很多方面有着巨大的潜在利用价值，玉米秸秆高值化利用是近几年来的热门话题[3]。以农林生物质材料制备新型功能性聚合糖——低聚木糖逐渐成为研究者的研究热点。关海宁等[4]通过响应面法对微波预处理辅助木聚糖酶制备稻壳低聚木糖的工艺进行了优化；孙军涛等[5]通过单因素和正交试验确定了超声波辅助复合酶法制备玉米芯低聚木聚糖的最佳工艺。玉米秸秆中半纤维素含量较高，且为木聚糖类半纤维素，是制备低聚木糖的理想原料，超声波在酶催化水解过程中具有协同作用[6]。本试验采用超声波处理玉米秸秆，用木聚糖酶和纤维素酶组成的复合酶对超声波处理后的玉米秸秆液进行酶解制备低聚木糖，该方法反应条件温和可控、安全、无污染，创新了以玉米秸秆为原料制备低聚木糖技术，提高了玉米秸秆附加值利用，对保护环境，维护生态平衡有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料：玉米秸秆收集于郑州市荥阳郊区，除去秆皮，粉碎过60目筛，用水洗净，于45℃鼓风干燥箱中烘干，装密封袋备用。

1.2 主要试剂

木聚糖酶和纤维素酶，上海源叶生物科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸，天津市大茂化学试剂厂；乙腈，色谱级，天津市大茂化学试剂厂；木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖的分析标准品，上海源叶生物科技有限公司。

1.3 试验仪器设备

HH-US型恒温振荡培养箱，江苏新春兰科学仪器有限公司；ES-J型分析天平，厦门莱斯德科学仪器有限公司；UV-8000型紫外分光光度计，上海精密仪器仪表公司；TGL-16型离心机，长沙湘仪试验仪器有限公司；XO-1800D超声波细胞粉碎机，南京先欧仪器制造有限公司：LC981-AAA型高效液相色谱仪，上海五丰科学仪器有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1超声波-复合酶法制备玉米秸秆低聚木糖工艺方法

1.4.1.1超声处理玉米秸秆提取木聚糖

考察不同超声波温度和超声处理时间对木聚糖提取率的影响。称取20.00 g玉米秸秆放入烧杯，加入400 mL去离子水后进行超声波处理。

1.4.1.2复合酶水解制备低聚木糖

用NaOH溶液调节超声处理后玉米秸秆液pH值至5.8，添加一定量配比的复合酶，在50℃恒温振荡培养箱中酶解。酶解结束后，将酶解液置于沸水浴煮沸10 min灭酶活性。取上清液测定还原糖含量、可溶性总糖含量和平均聚合度。

1.5 试验分析方法

1.5.1还原糖含量测定：DNS法[7]；

1.5.2可溶性总糖测定

向酶解后的玉米秸秆渣液中加入质量浓度为72.00 g/L的浓硫酸，沸水浴2 h，冷却后，用6 mol/L的氢氧化钠溶液中和至中性，用DNS法测定可溶性总糖的含量。

1.5.3平均聚合度（DP）的计算

DP=可溶性总糖含量/还原糖含量

1.5.4单因素试验

分别选择超声波温度、超声处理时间、木聚糖酶和纤维素酶配比、复合酶添加量和酶解时间作为影响因素，以酶解液中还原糖含量、可溶性总糖含量及平均聚合度为指标，研究各因素对制备玉米秸秆低聚木糖的影响。

1.5.5超声波-酶法制备玉米秸秆低聚木糖优化试验

在单因素试验的基础上，采用响应面法（Box-Behnken）试验设计原理，以超声波温度、超声处理时间、复合酶添加量、酶解时间为影响因素，以酶解液中还原糖含量为响应值，设计4因素3水平的响应面优化试验方案。

1.6 低聚木糖高效液相色谱法（HPLC）分析

色 谱 柱：ShimNex S-NH2-SOG，3.5 μm，4.6×250mm；流动相：乙腈：水65：35；流速：10 mL/min；进样量10 μL；柱温：80℃；样品浓度：20 mg/mL。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1超声波温度对玉米秸秆低聚木糖制备的影响

分别设定超声波温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的条件下，超声处理玉米秸秆60 min，添加2.0%（相对于玉米秸秆干物料，下同）的复合酶（木聚糖酶和纤维素酶按1∶1配比）酶解3 h，考察超声波温度对低聚木糖制备的影响。结果如图1所示：随着超声波温度的升高，还原糖含量和可溶性总糖含量先逐渐升高后有些许降低，平均聚合度随温度升高逐渐降低。当超声波温度达到50℃时，还原糖含量和可溶性总糖含量达到最大，分别为36.87mg/g和75.29 mg/g，此时平均聚合度为2.04。这是因为玉米秸秆中半纤维素是以氢键和范德华力与木质素紧密连接，使得植物细胞之间具有一定的抗降解能力，阻止了结构多糖的酶解聚合，超声波主要通过空化效应与机械效应作用于玉米秸秆，超声温度越高，产生的超声波空化效应越剧烈，对玉米秸秆细胞壁的破碎能力越强，利于糖组分的溶出。但随着超声波温度的继续升高，破坏糖的结构，使还原糖糖含量和可溶性总糖含量下降。故超声波温度选择50℃。

图1 超声波温度对玉米秸秆低聚木糖制备的影响

2.1.2超声波处理时间对玉米秸秆低聚木糖制备的影响

设定超声波温度50℃，分别超声处理玉米秸秆20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，添加2.0%复合酶（木聚糖酶和和纤维素酶酶按1∶1配比）酶解3h，考察超声处理时间对低聚木糖制备的影响，结果如图2所示：随着超声处理时间的延长，还原糖含量和可溶性总糖含量先升高后逐渐降低，平均聚合度逐渐降低；当超声超过处理时间达到40 min时，还原糖含量和可溶性总糖含量最高，分别为：35.93 mg/g和73.86 mg/g，此时平均聚合度为2.06。这是因为刚开始超声处理时超声波产生的空化效应、机械效应促进玉米秸秆结构的破坏，加速糖的溶出；但随着超声处理时间的延长，部分溶出的糖降解为糠醛，导致酶解液中还原糖含量和可溶性总糖含量降低。因此，选择超声处理时间为40 min。

图2 超声波处理时间对玉米秸秆低聚木糖制备的影响

2.1.3复合酶配比对玉米秸秆低聚木糖制备的影响

设定超声波温度50℃处理玉米秸秆40 min，添加2.0%复合酶（木聚糖酶和纤维素酶分别按3∶1、2∶1、1∶1、1∶2配比）酶解3 h，考察复合酶配比对低聚木糖制备的影响，结果如图3所示：当木聚糖酶与纤维素酶配比为2∶1时，酶解液中还原糖含量最大，达到34.76 mg/g，可溶性总糖含量为49.91 mg/g，平均聚合度为2.08。这是因为木聚糖通过木聚糖酶、纤维素酶等进行水解，由于木聚糖酶具有优异的定向水解能力，能够随着酶解反应的深入，破坏植物细胞结构，使更多低聚木糖溶出。当纤维素酶占的比例大时，纤维素酶充分降解了植物细胞壁的纤维素骨架，使木聚糖很容易从细胞壁中溶出，溶出的总糖量增加，因为木聚糖与酶蛋白间反应位点空间有限，当木聚糖酶过量时这些活性位点将会全部被木聚糖酶占据，而多余的酶只会与底物形成无效吸附，反而使酶解率降低、成本增加；而木聚糖酶占的比例较低时，没有足够的木聚糖酶降解木聚糖，使还原糖的量降低。综合还原糖、可溶性总糖量以及平均聚合度指标，复合酶的配比选择2∶1。

图3 复合酶配比对玉米秸秆低聚木糖制备的影响

2.1.4复合酶添加量对玉米秸秆低聚木糖制备影响

选择温度为50℃超声处理玉米秸秆40 min，分别添加0.25%、0.50%、1.00%、1.25%、1.50%的复合酶（木聚糖酶和纤维素酶之比为2∶1）酶解3 h，考察复合酶添加量对低聚木糖制备的影响。结果如图4所示：还原糖含量和可溶性总糖含量均呈现先升高后下降的趋势，当复合酶的添加量从0.50%增加至1.00%时，可溶性总糖的含量和平均聚合度逐渐增加，并在复合酶添加量为1.00%时还原糖含量和可溶性总糖达到最高，分别为34.87 mg/g和68.25mg/g。此时平均聚合度为1.96。平均聚合度随着复合酶添加量的增大逐渐减小。这是因为当复合酶添加量小于1.00%时，酶解反应体系中底物木聚糖过量，反应速率的增加随着复合酶的增加而增大。随着复合酶添加量进一步增加，还原糖的产量略有下降。这可能是由于反应体系中自由水的量减少，混合效率低下，导致物质间的传质效能降低，进而限制了木聚糖水解进程。因此，选择复合酶的添加量为1.00%。

图4 复合酶添加量对玉米秸秆低聚木糖制备的影响

2.1.5酶解时间对玉米秸秆低聚木糖制备的影响

在超声波温度50℃条件下处理玉米秸秆40min，添加1.0%的复合酶（木聚糖酶和纤维素酶之比为2∶1），分别酶解10 min、20min、30 min、40 min、50 min，考察复合酶酶解时间对低聚木糖制备的影响。结果如图5所示：还原糖含量和可溶性总糖含量均呈现先升高后有些许下降，平均聚合度逐渐降低。当酶解30 min时，酶解液中还原糖含量和可溶性总糖达到最高，分别为35.37 mg/g和68.49 mg/g。此时平均聚合度为1.94。在酶解反应初期，木聚糖酶与木聚糖粗液充分接触，使得还原糖和总糖产量迅速上升，随着木聚糖粗液消耗量不断加大，反应趋于相对饱和的状态，最后还原糖质量浓度呈现平稳的状态。考虑到酶反应的高效性以及酶的活性会随时间的延长会逐渐降低，还原糖含量增加不明显，反应时间过长会增加能耗。综合还原糖、可溶性总糖量以及平均聚合度指标，选择酶解时间为30 min。

图5 酶解时间对玉米秸秆低聚木糖制备的影响

2.2 采用响应面分析法对超声波-酶法制备玉米秸秆低聚木糖的工艺的优化

综合2.1单因素试验结果，运用Box-Behnken试验设计原理，以还原糖含量为响应值，设计4因素3水平的响应面优化试验方案。试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面因素设计水平

2.2.1响应面分析方案及结果

由Design-Expert软件做响应面优化试验，试验结果见表2。

表2 响应面分析方案及结果

2.2.2方差分析

利用Design-Expert软件对所得结果进行方差分析，结果如表3。

从表3可知：模型P＜0.000 1，说明该模型高度显著，失拟项P=0.152 4（＞0.05），说明失拟项不显著。说明模型拟合良好，试验误差小，可以通过此模型来预测玉米秸秆低聚木糖制备的最优条件。一次项(A、C、D)、交互项A和C、二次项（A2、D2）对结果影响显著(P≤0.05)，说明因素超声波温度，复合酶添加量和酶解时间对还原糖含量的影响线性关系显著，超声波温度和复合酶添加量交互作用对低聚木糖制备影响显著。

2.2.3响应曲面图分析

通过Design Expert 10.0.7软件分别做出超声波温度和复合酶添加量交互作用的响应曲面，结果如图6所示：超声波温度和复合酶添加量对水解液中还原糖含量的影响显著，还原糖含量的变化均是随两者的增大而增大。随着超声波温度的升高，复合酶添加量减小，表现为曲线较陡，曲面图越陡表示交互作用强。超声波温度和复合酶添加量之间的交互作用对玉米秸秆制备低聚木糖的影响与表3中的方差分析结果一致。

图6 超声波温度和复合酶添加量的交互作用对低聚木糖制备结果影响的响应面图

表3 回归模型方差分析表

2.2.4最佳提取条件的验证

通过Design Expert 10.0.7软件预测最佳制备玉米秸秆低聚木糖的条件：超声波温度56.38℃，超声处理时间42.89 min，复合酶添加量0.806%，酶解时间28.17 min，酶解液中还原糖含量36.24 mg/g。为了验证预测条件与实际工艺的符合性，做验证试验，结合实际情况，选择超声波温度56℃，超声处理时间40 min，复合酶添加量0.80%，酶解时间30 min，做3次平行验证，酶解液中还原糖含量实际平均值为36.43 mg/g，与理论预测值基本一致。此时，可溶性总糖含量为74.32 mg/g,平均聚合度为2.04。表明该模型可较好地拟合玉米秸秆低聚木糖制备过程。

2.2.5HPLC成分分析

从低聚木糖的HPLC分析图可以看出：制备的低聚木糖产物除少量木糖外，主要是木二糖和木三糖。木二糖和木三糖在酶解产物中占比82.7%。低聚木糖组成不同，功能不同，作为益生元的一种，低聚木糖的活性组分以木二糖、木三糖和木四糖为优，可改善肠道微生态，调节人体生理机能，促进机体对钙、铁等矿物质吸收[8]。用此方法制备的低聚木糖可很好满足低聚木糖作为益生元的活性组分的需求。

图7 低聚木糖的HPLC分析图

3 结论与讨论

应用响应面分析法优化超声波-复合酶法制备玉米秸秆低聚木糖工艺，得出最佳工艺条件为：超声波温度56℃，超声处理时间40 min，复合酶（木聚糖酶和纤维素酶之比为2∶1）添加量0.8%，酶解时间30 mim，酶解液中还原糖含量为36.43 mg/g，可溶性总糖含量为74.32 mg/g,平均聚合度为2.04。HPLC分析显示：制备的低聚木糖的主要成分为木二糖和木三糖。该研究结果可为超声波-复合酶法制备玉米秸秆低聚木糖工艺提供一定的参考依据。