高效液相色谱法同时测定丹参药材和饮片中苋菜红、胭脂红、金胺O含量*

张 华，朱泽兵，马英杰，阳文武

（重庆市万州食品药品检验所·三峡库区道地药材开发利用重庆市重点实验室，重庆 404000）

丹参是唇形科植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根茎，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦功效，主治冠状动脉粥样硬化性心脏病、心绞痛、心烦不眠、月经不调、经闭痛经等症［1］。丹参药用历史悠久，用途广泛，为大宗常用中药，还是国家卫生健康委员会公布的“保健食品”品种。药理实验证明，丹参水溶性成分具有抗氧化、抗菌和治疗心脑血管疾病的功效，故丹参为预防和治疗心脑血管疾病的常用药［2-7］。苋菜红、胭脂红、金胺O均为人工合成色素，其色系与丹参颜色相近，极易用于丹参药材与饮片的染色。但这3种色素服用过量会危害人体健康。含有苋菜红的物品长期食用有致癌性，尤其对婴幼儿伤害极大；胭脂红毒理学实验显示其具有一定致癌和致突变作用；金胺O对皮肤黏膜有轻度刺激作用，可引起结膜炎、皮炎和上呼吸道刺激症状，长期过量食用，将对人体肾脏、肝脏造成损害甚至致癌［8］。近年来，中药材中擅自添加色素及饮片染色问题依然严重［9］。《2019年全国中药材及饮片质量分析报告》指出，丹参、五味子、朱砂等部分市售品种存在染色现象［10］。目前，检测中药材或饮片中非法染色的研究较多［11-13］，但尚未见同时检测丹参中苋菜红、胭脂红、金胺O 3种常见合成色素方法的报道。为了提高丹参的质量和保障临床安全用药，本研究中建立了同时检测丹参药材和饮片中苋菜红、胭脂红、金胺O含量的高效液相色谱法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司），配有二极管阵列（SPD）检测器；KH-2000DB型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司，功率为800 W，频率为40 kHz）；SQP型分析天平（德国Sartorius公司，精度为0.0001 g）；SCI-20-D型超纯水机（重庆科润水处理设备有限公司）。

1.2 试药

甲醇（色谱纯，北京迪马科技有限公司）；乙酸铵（优级纯，天津光复科技发展有限公司）；苋菜红标准溶液（批号为19001），胭脂红标准溶液（批号为19001），金胺O标准溶液（批号为19002），均购自中国计量科学研究院标准物质研究与管理中心，质量浓度均为1000 μg/mL；丹参药材（编号为1-2），产自四川和河南，经重庆市万州食品药品检验所张德伟副主任中药师鉴定均为正品；丹参饮片（编号为3-23），样品信息见表1。

表1 丹参饮片样品信息Tab.1 Information of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma Pieces Samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：中谱红RD-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.05 mol/L乙酸铵溶液（B），梯度洗脱（洗脱程序见表2）；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；检测波长：512 nm（苋菜红和胭脂红），432 nm（金胺O）；进样量：10 μL。

表2 流动相梯度洗脱程序Tab.2 Program of gradient elution of mobile phase

2.2 溶液制备

分别精密量取标准溶液各适量，配制成质量浓度分别为1，5，10，20，50 μg/mL的系列混合标准溶液。取样品1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定质量，超声提取（功率为250 W，频率为40 kHz）30 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。取混合标准溶液和供试品溶液各适量，置同一容量瓶中，混匀，即得加标供试品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2项下混合标准溶液、加标供试品溶液和供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，结果目标化合物分离度良好。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图1.Amaranth 2.Carmine 3.Auramine OA.Mixed standard solution B.Test solution adding mixed standard solution C.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：取2.2项下混合标准溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标、待测成分的质量浓度（X，μg/mL）为横坐标进行线性回归。结果见表3，表明苋菜红、胭脂红、金胺O的质量浓度在1～50 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

检测限与定量限确定：取样品1 g，精密称定，置20 mL容量瓶中，加入较低质量浓度的混合标准溶液，加甲醇溶解并定容，按2.1项下色谱条件进样测定，分别以信噪比为3∶1和10∶1时的质量浓度确定检测限和定量限。结果见表3。

精密度试验：取2.2项下混合标准溶液（质量浓度为10 μg/mL），按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，结果见表3，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取同一加标供试品溶液，分别于0，4，8，12，16，20，24 h时按2.1项下色谱条件进样测定，计算各化合物峰面积的RSD。结果见表3，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

表3 方法学考察结果Tab.3 Results of the methodological investigation

加样回收试验：取样品6份，精密称定，分别精密加入适量混合标准溶液，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别进样测定，以加标前后所测定含量计算各色素的加样回收率。结果见表4，表明方法准确度良好。

表4 加样回收试验结果（n=6）Tab.4 Results of the recovery test（n=6）

2.4 样品检测

取丹参药材（编号为1-2）和饮片（编号为3-23），按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，结果仅编号为1和2的样品检出金胺O，含量分别为0.16 mg/kg和0.21 mg/kg，其余样品中均未检出或检出量低于定量限，未发现非法添加情况，但不排除存在其他安全隐患。

3 讨论

3.1 色谱条件考察

通过单因素试验对色谱柱（中谱红RD-C18柱、Diamonsil C18柱、Sepax C18柱和Inertsustain C18柱），柱温（25，30，35℃），进样量（10，15，20 μL），流速（0.8，1.0，1.2 mL/min）及流动相系统（甲醇-0.05 mol/L乙酸铵溶液、乙腈-0.05 mol/L乙酸铵溶液、甲醇-0.025 mol/L磷酸二氢钾溶液和甲醇-水溶液）进行了考察。结果发现，当选择2.1项下色谱条件时各成分分离度良好，色谱峰峰形呈正态分布。同时，采用SPD检测器对各标准溶液于190～800 nm波长范围内扫描发现，苋菜红和胭脂红于512 nm波长附近有最大吸收；金胺O于432 nm波长附近有最大吸收，而于512 nm波长处吸收较弱。为保证各待测成分均能得到较好响应，且减少干扰峰，最终确定2.1项下色谱条件。

3.2 样品前处理优化

本研究中对不同提取溶剂（水、30%甲醇溶液、70%甲醇溶液、甲醇），浸泡时间（0，30，40，60 min），提取方法（超声提取和加热回流提取），超声提取时间（20，30，40 min）进行了考察，最终确定以甲醇超声处理30 min为样品提取条件。

3.3 方法评价

本方法操作简便快捷、适用范围广、专属性强、重复性好，可用于丹参药材和饮片中3种合成色素非法染色的快速筛查，有助于更好地控制丹参的质量，保障其临床安全用药。