HPLC法测定诺氟沙星胶囊的有关物质

★李丽云 黎艳刚 朱海（云南省药物研究所/云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室 昆明 650111）

诺氟沙星又称氟哌酸，是人工合成的第三代喹诺酮类抗菌药，1979年日本杏林制药公司发现了该化合物并申请了专利。1983年该药由默沙东作为申请人在意大利最初上市生产，当时采用片剂形式，商品名为Noroxin。1984年由杏林制药作为申请人在日本上市生产，所用商品名为Baccidal，同样采用片剂形式，该药目前仍然在日本上市。诺氟沙星胶囊于1987年在国内上市，目前有批文690余条[1］，已有两家制药企业通过仿制药质量和疗效一致性评价。诺氟沙星在抗菌方面具备广谱性，特别在抵抗需氧GNB（革兰阴性杆菌）方面具备高效性，于体外可有效抑制肠杆菌科细菌中的多数菌属，同时体外可抵御多种耐药菌，对因敏感菌引发的尿路感染、伤寒、淋病、肠道感染、前列腺炎、其它沙门菌感染等具有治疗作用[2］。

本文通过对中国药典[3］所收载的诺氟沙星胶囊有关物质检测方法及欧洲药典所收载、参考文献[4］所记载的诺氟沙星有关物质检测方法进行了考察和对比，发现上述方法存在杂质控制不严、溶剂峰对主峰及杂质峰的测定产生干扰、梯度洗脱过程中容易出现基线波动等不足。因此，此项研究经色谱条件的筛选，完成诺氟沙星胶囊相关物质测定方法的建立，同时对其开展方法学验证。

1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪，奥豪斯EX125ZH电子天平，梅特勒 DELTA 320型pH计。

诺氟沙星对照品及杂质A对照品、环丙沙星（Ciprofloxacin）对照品、依诺沙星（Enoxacin）对照品，均购于中国食品药品检定研究院；诺氟沙星杂质D对照品及杂质2对照品均购于TLC公司；诺氟沙星杂质H对照品、杂质B对照品、杂质K对照品及杂质E对照品均购于CATO公司；诺氟沙星胶囊（自研）。甲醇为色谱纯，水为纯化水；其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用安捷伦 ZORBAX SB-C18色谱柱（5 μm× 4.6 mm×250 mm）；流动相A为0.015 mol/L磷酸溶液（由三乙胺将pH调节为3.0±0.1）-甲醇（85∶15），流动相B为甲醇，根据表1实施线性梯度洗脱处理；柱温、流速分别设定为30 ℃、1.0 mL/min；测定波长为262 nm与278 nm。

2.2 溶液的配制

稀释剂：即“2.1”项下的流动相A。

供试品溶液：取适量诺氟沙星胶囊内容物（与15 mg诺氟沙星相当），精密称定，移至100 mL量瓶内，用2 mL盐酸溶液（0.1 mol/L）溶解，再通过流动相A定容至100 mL，摇匀后滤过，即得供试品溶液。

各杂质对照品贮备液：分别取诺氟沙星杂质D、K、B、E 、2、A、H对照品约15 mg，精密称定，移至100 mL量瓶内，用2 mL盐酸溶液（0.1 mol/L）溶解，再通过流动相A定容至100 mL，摇匀，即得对照品贮备液。

峰定位溶液：取诺氟沙星对照品约15 mg，精密称定，移至100 mL量瓶内，用2 mL盐酸溶液（0.1 mol/L）溶解，分别量取上述杂质对照品贮备液各4 mL，再通过流动相A定容至100 mL，摇匀，作为峰定位溶液。

系统适用性溶液：分别取环丙沙星对照品和依诺沙星对照品约15 mg，精密称定，移至50 mL量瓶内，用2 mL盐酸溶液（0.1 mol/L）溶解，加流动相A定容至50 mL，摇匀；再取诺氟沙星对照品约15 mg，精密称定，并移至100 mL量瓶内，用2 mL盐酸溶液（0.1 mol/L）溶解，再加入1 mL上述混合液，之后通过流动相A定容至100 mL，摇匀，即得系统适用性溶液。

空白辅料溶液：取适量诺氟沙星空白辅料（与15 mg的诺氟沙星相当），精密称定，再移至100 mL量瓶内，通过2 mL盐酸溶液（0.1 mol/L）溶解，再通过流动相A定容至100 mL，摇匀后滤过，即得空白辅料溶液。

2.3 系统适用性试验

取“2.2”项下制备的峰定位溶液、系统适用性溶液分别进样，对色谱图进行记录。所得结果见图1，系统适用性溶液和峰定位溶液中各杂质与主峰、杂质与杂质之间分离完全，分离度均大于2.0，理论塔板数均大于4 000，符合系统适用性要求。

2.4 专属性试验

2.4.1 辅料干扰试验 取“2.2”项下制备的峰定位溶液、供试品溶液、空白辅料溶液与稀释剂分别进样，对色谱图进行记录。所得结果见图1，各杂质峰处均未见空白辅料与稀释剂出峰，表明辅料与溶剂皆不会影响对诺氟沙星胶囊的杂质测定。

图1 典型色谱图

2.4.2 强制降解试验 取“2.2”项下供试品溶液和空白辅料溶液，分别置于2 mol/L盐酸溶液中、105 ℃条件下酸破坏4 h；2 mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液内，105 ℃温度时碱破坏4 h；30%双氧水溶液0.1 mL中，105 ℃条件下氧化破坏3 h；105 ℃高温下破坏24 h；光照（5 000±500）lx条件下1个月，处理完成后分别进样，记录色谱图。结果表明诺氟沙星胶囊在酸、碱、氧化、高温、光照条件下均相对稳定，产生的降解产物较少，各降解产物峰与诺氟沙星主峰能完全分离，峰纯度合格，满足专属性强制破坏要求。

2.5 线性和范围

取诺氟沙星对照品约15 mg，精密称定，移至100 mL量瓶内，用2 mL盐酸溶液（0.1 mol/L）溶解，再通过流动相A定容至100 mL，摇匀，即得诺氟沙星对照品贮备液；分别精密量取“2.2”项下各杂质对照品贮备液1 mL以及上述诺氟沙星对照品贮备液1 mL，移至25 mL量瓶内，通过流动相A定容至25 mL，摇匀，即得对照品混合溶液；对此混合液分别进行不同量的准确量取：0.01、0.015、0.02、0.03、0.04、0.06、0.1 mL，逐一移至液相色谱仪，对色谱图进行记录。横坐标（X）、纵坐标（Y）分别为“对照品的进样量（单位：ng）”“峰面积”，开展线性回归，得到回归方程与相关系数r。见表2。

2.6 定量限和检测限

分别量取“2.2”项下各杂质对照品贮备液及“2.5”项下诺氟沙星对照品贮备液适量，用流动相A稀释至信噪比为10∶1和3∶1的浓度，精密量取上述对照品溶液各0.02 mL，注入液相色谱仪，记录色谱图。见表2。

表2 诺氟沙星及已知杂质的线性关系及灵敏度测定结果

2.7 精密度试验

2.7.1 仪器精密度 精密量取1 mL“2.5”项下诺氟沙星对照品贮备液，移至25 mL量瓶内，用流动相A定容至25 mL，摇匀，即得对照品溶液。精密量取上述对照品溶液0.02 mL，注入液相色谱仪，共进行6次不间断进样，记录色谱图，通过主峰峰面积与保留时间的RSD波动，考察仪器于此色谱条件下的精密状况。结果显示，关于对照品溶液，其主峰峰面积、保留时间RSD值依次是1.88%、0.69%，可见仪器于此色谱条件下具备良好精密度表现。

2.7.2 重复性 依照“2.2”项下制备供试品溶液的方法，完成6份供试品溶液的制备，之后分别准确吸量0.5 mL，移至100 mL量瓶内，通过流动相A定容至100 mL，摇匀，即得对照溶液；分别准确吸量此对照溶液与供试品溶液0.02 mL，移入液相色谱仪，对色谱图进行记录，根据外标法，通过峰面积对已知杂质含量展开求解，得到杂质K的RSD值是1.97%，可见此法具备良好重复性。

2.7.3 中间精密度 依照“2.2”项下制备供试品溶液的方法，由不同操作者，借助不同仪器于不同时间，取12份批次相同的样品进行重复检测，考察方法的中间精密度，其中第1天的数据引用重复性项下的结果，结果显示杂质K的RSD值等于3.93%，可见此法具备良好中间精密度。

2.8 准确度试验

分别量取“2.2”项下各杂质对照品贮备液及“2.5”项下诺氟沙星对照品贮备液2 mL，移至50 mL量瓶内，通过流动相A定容至50 mL，摇匀，即得对照品混合贮备液；之后量取2.5 mL，移至50 mL量瓶内，通过流动相A定容至50 mL，摇匀，即得对照品混合溶液。取空白辅料适量，精密称定，置50 mL量瓶中，分别加入对照品混合贮备液2.0、2.5和3.0 mL，通过流动相A定容至50 mL，摇匀后滤过，取续滤液制备不同浓度供试品溶液，低、中、高浓度依次为80%、100%、120%，各浓度皆重复配样3份，分别移入液相色谱仪，对色谱图进行记录，借助外标法，经由峰面积对已知杂质含量展开计算。结果显示，诺氟沙星杂质D、K、B、E、2、A、H及诺氟沙星的平均回收率为99.19%、107.95%、98.85%、103.43%、106.16%、106.05%、102.35%、99.04%，RSD值为0.60%、2.40%、1.28%、1.51%、1.28%、1.29%、0.98%、2.64%，表明本法检查有关物质的准确度良好。

2.9 溶液稳定性试验

依照“2.2”项下制备供试品溶液的方法进行供试品溶液的制备，静置于室温中，分别于0、4、8、12、16、20、24 h精密吸量上述样品溶液0.02 mL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果显示，供试品溶液内总杂质、最大单杂、已知杂质皆未见明显改变，同时无新杂质形成，可见供试品溶液于室温静置24 h依然具备稳定性。

2.10 耐用性试验

经由调整流速、流动相比例、磷酸盐酸碱度、柱温、厂家不同、批号不同的色谱柱来考察拟定色谱条件的耐用性。准确吸量0.02 mL供试品溶液，移至液相色谱仪，对色谱图进行记录。结果表明当流速变动±10%、柱温变动±5 ℃、磷酸盐pH值变动±0.2、流动相的比例变动±2%、改变色谱柱时，对测定结果不造成影响，说明本法对流速、柱温、磷酸盐pH值、流动相的比例、色谱柱的耐用性良好。

2.11 样品测定

按照经方法学验证的有关物质检查方法，对自研诺氟沙星胶囊的有关物质进行检查。见表3。

表3 关物质检查结果………… %

3 讨论

据文献报道，河南省药检所于2018年对43批次诺氟沙星胶囊进行了有关物质专项监督抽验，按现行标准检测，部分批次的诺氟沙星胶囊主峰前有一杂质峰与主峰未完全分离，该杂质峰应为杂质E[5］；与此同时，浙江省台州市药检所于2017年对57批次诺氟沙星胶囊进行了抽验，有关物质研究结果发现，3个厂家的5批次样品中检出杂质E超标，1批检出杂质K在限度边缘[1］。因此，为有效控制产品质量，诺氟沙星胶囊的有关物质检测方法需要修订提高。

本研究是在《中国药典》收载的诺氟沙星胶囊有关物质检测方法的基础上，对色谱条件进行了调整，经专属性、线性、定量限和检测限、精密度、准确度、耐用性等试验的验证后，确认该检测方法不仅准确可靠，而且可以检测出诺氟沙星的7个杂质，尤其是诺氟沙星原料于合成期间生成的杂质E和杂质K。如表3所示，自研的诺氟沙星胶囊中含0.12%的杂质K，说明该有关物质检测方法更有利于控制原料药及产品的质量。