单一和复合乳酸菌添加对高丹草青贮效果的影响

付薇，陈伟，王小利，周丽，覃涛英，韩永芬*，孟军江

（1贵州省草业研究所，贵州贵阳 550006；2贵州金农富平生态农牧科技有限公司，贵州铜仁 554100）

0 引言

【研究意义】高丹草（×）是由饲用高粱［（L.）Moench］和苏丹草［（Piper）.Stapf］杂交产生的禾本科高光效C4植物，其鲜草产量高，再生能力强、抗倒伏、粗蛋白质含量高，饲喂家畜消化率高、适口性好（白春生等，2020）。6—9月是高丹草的生长旺季，集中生长通常造成鲜草过剩，利用乳酸菌发酵迅速降低体系pH，最大程度减缓植物呼吸，抑制好氧微生物生长，是目前长效保存高丹草的常用办法。【前人研究进展】国内学者从营养供给、留茬高度、混合青贮等方面对高丹草发酵效果开展了一定研究。白春生等（2020）通过不同施氮量和留茬高度开展高丹草发酵品质比较研究，结果表明施氮量300 kg/ha时，高丹草青贮发酵品质良好，留茬高度从15 cm增至60 cm，可明显改善高丹草青贮饲料的营养价值；张欢等（2020）、郭晖（2021）开展高丹草与紫花苜蓿混贮比例研究，结果表明混合高丹草能显著降低青贮pH，各混贮比例间发酵品质差异显著；尤思涵等（2021）研究高丹草与黑麦草混贮效果，结果表明高丹草与黑麦草以3∶7比例混贮，可获得最高乳酸值和乳酸菌数量。有研究发现，添加适宜乳酸菌可快速主导发酵，有效增加环境乳酸含量、加速青贮进程，对改善底物营养品质有着积极的促进作用（许冬梅等，2017；周俊华等，2020）；但不同类型乳酸菌具有不同的发酵功能，底物种类、乳酸菌类别、菌系间协同作用等多种因素均会对青贮的终期发酵效果产生不同程度的影响（Liu et al.，2016；Oliveira et al.，2017）。植物乳杆菌（）和戊糖片球菌（）是青贮常见的同型发酵乳酸菌，在快速增加乳酸含量、降低pH和减缓营养损失方面效果显著（关皓等，2017）；李小铃等（2019）利用植物乳杆菌、戊糖片球菌和食窦魏斯氏菌（）复合添加发酵扁穗牛鞭草，其微生物菌群和感官品质最优，乳酸含量最高。短乳杆菌（）为异型发酵乳酸菌，青贮时能产生大量抑制酵母菌、霉菌等好氧微生物生长的乙酸（黄峰等，2019）。徐生阳等（2019）研究指出，短乳杆菌对防止全株玉米青贮有氧腐败变质有显著作用。【本研究切入点】不同乳酸菌复合添加对不同作物青贮效果的影响有所差异（苗芳等，2017；王旭哲等，2018），但其对高丹草青贮品质及微生物变化的影响研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以前期从禾本科牧草中筛选出的植物乳杆菌、戊糖片球菌和短乳杆菌为试验材料，通过单一和复合乳酸菌添加，探索不同菌剂组配对高丹草青贮效果的影响，为高丹草优良青贮菌剂的研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青贮原料为蜀草1号高丹草，于2018年4月12日播种于贵州省草业研究所松桃县高产饲草基地，种植面积0.67 ha，种植行距50 m×50 m，2018年7月31日蜡熟初期收割。供试菌种是贵州省草业研究所前期从禾本科牧草中分离获得的植物乳杆菌（保存编号LP06）、戊糖片球菌（保存编号PP02）和短乳杆菌（保存编号LBR02）。

1.2 试验方法

将高丹草晾晒至水分含量约65%，切碎至3～5 cm长度，装入聚乙烯袋（塑料袋规格为600 mm×500 mm），每袋1500 g。设8个菌剂添加处理：（1）CK（无乳 酸 菌）；（2）LP06；（3）PP02；（4）LBR02；（5）F-1（LP06∶PP02=1∶1）；（6）F-2（LP06∶LBR02=1∶1）；（7）F-3（PP02∶LBR02=1∶1）；（8）F-4（LP06∶PP02∶LBR02=1∶1∶1），每处理3次重复，乳酸菌添加量5×10CFU/g。按10 mL/kg的总剂量混合各乳酸菌组合，10倍无菌蒸馏水稀释后均匀喷洒至高丹草原料上，真空密封机抽气密封，常温贮藏60 d。

1.3 测定指标及方法

青贮60 d后开窖，对各处理进行感官品质评定，测定微生物数量、发酵品质和营养成分。

1.3.1 感官品质评定采用德国农业协会（Deutche Landwirtschaftes Gesellschaft，DLG）评分方法，根据气味、结构和色泽3项指标对各处理青贮品质感官进行评定，总分20分，其中气味14分，结构4分，色泽2分，得分16～20分为优等，10～15分为良等，5～9分为中等，0～4分为下等。

1.3.2 微生物数量测定包括乳酸菌、酵母菌和霉菌，称取20 g样品于180 mL无菌生理盐水（0.85%NaCl）中，4℃下振荡1 h后制备系列梯度稀释液（10～10）（李小铃等，2019）。各微生物均采用菌落计数法计数，将稀释液涂布于MRS固体培养基，37℃下厌氧培养72 h，统计乳酸菌菌落数；在马铃薯葡萄糖培养基上涂布稀释液，25℃下有氧培养72 h后统计酵母菌菌落数；于马丁培养基上涂布稀释液，25℃下有氧培养72 h，统计霉菌菌落数。

1.3.3 发酵品质测定包括pH、氨态氮（Ammonium nitrogen，NH-N）、乳酸、乙酸、丙酸和丁酸。pH采用酸度计（PHS-25）测定；NH-N含量采用苯酚—次氯酸钠比色法分析，乳酸及有机酸采用高效液相色谱法分析（Broderick and Kang，1980）。

1.3.4 营养成分测定包括干物质（Dry matter，DM）、粗蛋白质（Crude protein，CP）、可溶性碳水化合物（Water-soluble carbohydrates，WSC）、酸性洗涤纤维（Acid detergent fiber，ADF）和中性洗涤纤维（Neutral detergent fiber，NDF）。DM和CP含量参照AOAC（2005）的方法测定，其中DM采用烘干重量法，CP采用凯氏定氮法；WSC含量采用蒽酮—硫酸比色法（Dubois et al.，1956）测定，ADF和NDF含量采用范氏洗涤纤维法（van Soest et al.，1991）测定。

1.4 统计分析

使用Excel 2007对试验数据进行整理。采用SPSS v18.0进行单因子方差分析，并用邓肯氏法进行组间差异显著性分析。根据试验数据分析结果，用模糊数学隶属函数法对青贮60 d的感官品质、发酵品质、营养成分和微生物数量指标进行综合评价（苗芳等，2017），计算公式如下：

式中，为各指标正相关隶属函数值，为各指标负相关隶属函数值，为某指标测定值，和分别为某指标所有测定值中的最小值和最大值。以全部指标隶属函数值平均值大小进行排名。

2 结果与分析

2.1 单一和复合乳酸菌添加对高丹草青贮感官品质的影响

由表1可知，高丹草青贮发酵后，各处理均无酸臭味，茎叶结构保持较好，无腐败变质现象，LP06和F-1处理具有明显芳香果味，质地结构柔软松散，感官评分17分，感官品质优于其他处理。CK和LBR02处理叶片柔软但稍粘手，感官评分14分，青贮品质等级为良。

2.2 单一和复合乳酸菌添加对高丹草青贮主要微生物数量的影响

单一和复合乳酸菌添加对高丹草青贮主要微生物数量的影响效果见表2。高丹草乳酸菌初始数量较少，为3.61×10CFU/g，青贮后，全部处理附着的乳酸菌数量均显著高于青贮前乳酸菌数量（＜0.05，下同）；7个乳酸菌添加处理的乳酸菌数量也显著高于CK，其中LP06、F-1和F-4处理乳酸菌增殖效果最佳，数量均在7.00×10CFU/g以上，显著高于CK、LBR02和F-3处理。青贮60 d后，各处理酵母菌数量显著下降，其中LBR02、F-2和F-3处理未检测到酵母菌，酵母菌生长得到有效抑制。各处理霉菌数量显著下降，LP06、LBR02、F-2和F-3处理未检测到霉菌。综上，F-2处理有效增加高丹草青贮乳酸菌数量的同时，能显著抑制酵母菌和霉菌生长繁殖，微生物菌群整体表现最佳。

表1 不同菌剂添加对高丹草青贮感官评分的影响Table 1 Effects of adding different bacteria agents on sensory score of S.bicolor×S.sudanense silage

表2 不同菌剂添加对高丹草青贮60 d后主要微生物数量的影响（×105CFU/g）Table 2 Effects of adding different bacteria agents on major microbial quantity of S.bicolor×S.sudanense after 60 d silage（×105CFU/g）

2.3 单一和复合乳酸菌添加对高丹草营养成分的影响

由表3可知，高丹草青贮60 d后，8个处理的DM含量均有所下降，但青贮前后差异不显著（＞0.05，下同）。各处理CP营养有不同程度损失，7个乳酸菌添加处理CP含量显著高于CK，其中F-2处理CP含量较CK高10.2%。各处理WSC含量较青贮前大幅下降，降幅为52.34%～68.54%，其中CK的WSC营养损失最少，WSC含量为5.09%，显著高于7个乳酸菌添加处理，LP06、F-1、F-2和F-4处理营养损失最大，显著低于其他处理。青贮前后，各处理ADF和NDF含量变化不显著。

2.4 单一和复合乳酸菌添加对高丹草发酵品质的影响

单一和复合乳酸菌添加对高丹草青贮发酵品质的影响效果见表4。青贮60 d后，F-2处理pH表现最优，为3.88。CK的NH-N含量显著高于7个乳酸菌添加处理，含量最低的为F-2处理（0.086%），各乳酸菌添加处理之间NH-N含量差异不显著。青贮发酵显著提高高丹草乳酸含量，各乳酸菌添加处理乳酸含量显著高于CK，其中LP06和PP02处理的乳酸含量最高，分别为4.21%和4.03%，显著高于其他处理。全部处理乙酸含量相对发酵前显著增加，其中LBR02、F-2、F-3和F-4处理乙酸含量显著高于CK和其他3个同型发酵乳酸菌处理，以LBR02处理乙酸含量最高，为2.20%。高丹草青贮发酵前后均未检测到丙酸和丁酸。从发酵品质上看，F-2处理显著降低pH和NH-N含量的同时，有效提高青贮饲料乳酸和乙酸含量，发酵品质最佳。

2.5 单一和复合乳酸菌添加对高丹草青贮效果的综合评价

为全面评价各菌剂添加处理对高丹草青贮感官品质、发酵品质、营养成分和微生物数量影响的综合效果，利用隶属函数法对8个处理进行综合评定，其中感官品质、乳酸、乙酸、DM、CP、WSC含量和乳酸菌数量与发酵效果呈正相关，为正向指标，pH、NH-N、NDF、ADF含量及酵母菌、霉菌数量与发酵效果呈负相关，为负向指标，各处理均未检测出丙酸和丁酸，不纳入评价指标。以7个正向指标和6个负向指标的隶属函数值进行综合价值评定，隶属函数平均值越高表明该处理青贮效果综合表现越好，8个处理得分从高至低依次为：F-2处理（0.69）＞LP06处理（0.65）＞F-1处理（0.56）＞PP02处理（0.55）＞F-3和F-4处理（0.52）＞LBR02处理（0.51）＞CK（0.23）（表5）。

表3 不同菌剂添加对高丹草青贮60 d后营养成分含量的影响（%）Table 3 Effects of adding different bacteria agents on nutritional component of S.bicolor×S.sudanense after 60 d silage（%）

表4 不同菌剂添加对高丹草青贮60 d后发酵品质的影响Table 4 Effects of adding different bacteria agents on fermentation quality of S.bicolor×S.sudanense after 60 d silage

表5 不同菌剂添加对高丹草青贮发酵效果的综合评价Table 5 Effects of adding different bacteria agents on comprehensive evaluation of fermentation of S.bicolor×S.sudanense silage

3 讨论

3.1 不同类型乳酸菌添加对高丹草主要微生物数量和感官品质的影响

刘晗璐（2008）研究指出，因新鲜牧草中附着大量酵母菌、霉菌等好氧微生物，乳酸菌数量一般需达5×10CFU/g以上才易保障青贮发酵质量。本研究中高丹草初始乳酸菌数量仅为3.61×10CFU/g，含量低于酵母菌和霉菌总量7.46×10CFU/g。当牧草表面附着的乳酸菌数量过低时，可额外添加乳酸菌主导发酵以增加优势菌群，加速青贮发酵进程，抑制有害菌繁殖，降低营养损耗，从而获得优质的牧草青贮（李小铃等，2019）。本研究中，青贮60 d后的高丹草乳酸菌数量较青贮前大幅增加，以植物乳杆菌LP06单独添加和LP06与戊糖片球菌PP02复合添加增殖效果表现最优。李小铃等（2019）在单一和复合乳酸菌添加对扁穗牛鞭草青贮品质的影响中指出，植物乳杆菌单一添加乳酸菌增殖效果最佳，数量最多。

Filya（2003）在玉米和高粱的乳酸菌配比添加试验中指出，不同乳酸菌添加比例对乳酸菌的增殖速度有不同影响，一般同型发酵乳酸菌生长速度快于异型发酵乳酸菌，本研究结果也进一步证明了同型发酵乳酸菌在主导青贮发酵方面的优势。高丹草青贮60 d后，短乳杆菌单独添加、短乳杆菌+植物乳杆菌、短乳杆菌+戊糖片球菌3个处理均未检测出酵母菌和霉菌，对有害微生物的生长抑制效果显著。短乳杆菌LBR02是异型发酵乳酸菌，异型发酵乳酸菌在青贮过程中能产生大量乙酸，对提高青贮有氧稳定性、抑制有害菌生长有促进作用（塔娜等，2017；贾婷婷等，2018）。

青贮饲料的气味、色泽和结构等感官品质在一定程度上能反映青贮发酵优劣。LP06和F-1处理感官评定最优，与这2个处理乳酸含量和乳酸菌数量检测结果相吻合，表明以植物乳杆菌主导青贮发酵，能在发酵前期快速形成优势菌种，从而更易保障发酵的感官品质。短乳杆菌LBR02单一添加或与戊糖片球菌PP02以1∶1比例复合添加，在气味评分上得分较低，可能与短乳杆菌代谢有关，其合成自身氨基酸时分解蛋白质产生部分具有不良气味的氨和胺类物质（Juracek et al.，2018）。

3.2 不同类型乳酸菌添加对高丹草营养成分的影响

营养成分是评定青贮质量的关键指标，一般认为青贮饲料DM、WSC和CP含量与青贮质量呈正相关，含量越高，青贮质量越好。李小铃等（2019）研究表明，异型发酵乳酸菌食窦魏斯氏菌添加组青贮发酵的DM含量最高。张凡凡等（2021）利用纤维素分解菌与布氏乳杆菌联合接种，发现布氏乳杆菌可显著提高青贮玉米DM含量。本研究各处理间DM含量差异不显著，4个异型发酵短乳杆菌添加处理均未在DM含量上表现出明显优势，与李小铃等（2019）、张凡凡等（2021）的研究结果不一致，可能是因为不同发酵类型乳酸菌的不同比例、种类组合或受发酵底物影响，均会表现出不同的协同作用所致，但菌株之间、菌株与底物代谢间如何协同作用还需深入研究。

高丹草发酵60 d后，8个处理的CP含量同青贮前相比均出现不同程度降低，推测可能是发酵初期，体系内酸性环境尚未形成，蛋白质分解酶和部分微生物代谢活跃导致蛋白质快速分解所致（韩立英等，2013）。高丹草青贮60 d后，各处理CP含量较青贮前显著下降，可能与高丹草青贮后的呼吸作用、蛋白质分解酶和相关微生物代谢活动有关（韩立英等，2013），7个乳酸菌添加处理的CP含量均显著高于CK，也进一步证实了添加乳酸菌在抑制高丹草蛋白质降解方面的优势。青贮发酵时微生物需要能量来源以保证自身生长，WSC作为乳酸菌生长碳源摄取的主要底物，在青贮过程中被乳酸菌代谢消化，其含量可间接反映乳酸菌生长情况。本研究中，高丹草青贮60 d后，CK、戊糖片球菌和短乳杆菌单独添加或这2种菌复合添加的WSC含量显著高于其他处理，可能与这4个处理乳酸菌代谢活动相对较弱、WSC分解消耗较慢有关。NDF作为饲料纤维质量判定的有效标准，其含量高低可初步估测日粮精粗比例是否合理；ADF是饲料能值的重要评判指标，其含量与青贮饲料的饲用价值成反比。尤思涵等（2021）在高丹草与黑麦草混贮研究中指出，不同混贮比例的NDF和ADF含量存在明显差异，本研究中8个处理的ADF和NDF含量变化不显著，与尤思涵等（2021）的研究结果不一致，推测原因可能与发酵底物有关，本研究发酵底物为高丹草单贮，尤思涵等（2021）报道为高丹草与黑麦草混合青贮，混合青贮在一定程度上改变了营养物质的比例。

3.3 不同类型乳酸菌添加对高丹草发酵品质的影响

pH、NH-N、乳酸和乙酸含量是评判青贮发酵效果的关键指标。pH大小直接反映青贮饲料是否处于良好的酸性环境，对底物发酵至关重要，一般认为优良的青贮饲料pH为3.8～4.2。本研究中，全部同型发酵乳酸菌添加处理的pH均低于短乳杆菌LBR02单独添加处理，进一步体现了同型发酵乳酸菌在提升发酵进程方面的优势作用。研究表明，随着发酵进行，蛋白质被多种好氧微生物代谢繁殖所消耗，亦或通过不同途径被分解转化成NH-N和胺类物质，NH-N含量越高，间接反映底物蛋白质消耗越多（蒋苏苏等，2017）。一般认为NH-N含量≤5%，青贮发酵品质优良。本研究中，所有处理的NH-N含量极低，推测原因，一方面蜀草1号高丹草属高光效C4植物，WSC含量较高，丰富的WSC含量为青贮发酵提供了充足的碳源，各处理体系内乳酸菌群快速增殖形成酸性环境，pH均≤4.10，达优良饲草发酵pH，良好的酸性环境有效抑制了有害微生物对蛋白质的分解消耗；另一方面，可能与蛋白分解酶活性有关，随着pH降低，蛋白酶活性极大降低，很大程度上减少NH-N含量。

前人研究结果（王旭哲等，2018；徐生阳等，2019）表明，同型、异型乳酸菌单独添加或复合添加，均可获得较高的乳酸含量，且显著高于CK。同型、异型发酵乳酸菌生长代谢均可产生大量乳酸。本研究所用发酵底物高丹草的乳酸菌初始数量较低，自然发酵乳酸浓度增加较慢，乳酸菌添加后快速生长代谢，进而显著提高乳酸含量，与pH试验结果相吻合。除F-4处理外，其余3个异型发酵乳酸菌添加处理乙酸含量显著高于其他处理，其中短乳杆菌单独添加含量最高。黄峰等（2019）、李菲菲等（2019）研究指出，短乳杆菌、布氏乳杆菌和希氏乳杆菌等众多异型发酵乳酸菌不仅能产生乳酸，还会产生乙酸等抑制有害微生物生长的有机酸，LBR02、F-2和F-3 3个短乳杆菌添加处理的乙酸测定结果与酵母菌、霉菌抑制效果相一致，而F-4乙酸含量显著低于这3个处理，可能与短乳杆菌添加比例较低，生长代谢受影响有关。

4 结论

青贮60 d时，同型发酵乳酸菌LP06添加在提高高丹草青贮感官品质、降低NH-N含量、减少CP损失、增加乳酸含量和乳酸菌数量上表现更具优势，异型发酵乳酸菌LBR02在抑制有害微生物生长方面作用更显著。综上分析，植物乳杆菌LP06与短乳杆菌LBR02按1∶1比例复合添加，高丹草青贮效果综合表现最优。