不同发酵方式对柿子酒中挥发性香气成分的影响研究

冯翰杰，李涛，杨梅，巩文杰，张军

（天津农学院 食品科学与生物工程学院，天津 300392）

柿树是一种柿科（Ebenaeeae）柿属（Diospyros）落叶乔木，主要种植于亚热带和中温带，产区集中于中国、日本和韩国等地，此外朝鲜、菲律宾也有种植，生长环境温暖且光照充足。柿树原产于我国长江流域，在我国大部分地区均有栽种，已有千年种植历史[1]。研究发现，每100 g 柿子中含糖28 g，其他碳水化合物25 g，蛋白质1.36 g，脂肪0.2 g，磷19 mg，钙10 mg，铁8 mg，维生素C 16 mg，还含有胡萝卜素、氨基酸和多酚类物质[2]，易被人体消化吸收。柿子在抗动脉硬化[3]、预防心血管疾病[4]、抗肿瘤和抗痉挛[5]、止血[6]、降低胆固醇[7]等方面发挥着重要作用。还有研究表明，柿子在治疗皮肤病、内分泌系统疾病、心血管疾病和泌尿系统疾病等方面也有一定的药用价值[8-10]。

天津地区柿子产量较大，开发柿子酒可以避免柿子浪费，不同的发酵工艺对柿子酒香气成分的形成有很大影响。本试验采用电子鼻、气相-质谱及感官评价3 种技术手段对不同发酵方式柿子酒的香气成分进行研究，对比3 种不同发酵方式对柿子酒香气成分的影响，并通过主成分分析，确定不同发酵方式柿子酒的主要香气物质，对比香气物质差异。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柿子，购于天津市红旗农贸批发市场；酒样，实验室不同发酵工艺的柿子酒；标准品，正构烷烃标准溶液nC6-nC16；氯化钠，广东化学试剂厂；SY 安琪酵母，安琪酵母有限公司；亚硫酸，天津大茂化学试剂厂；果胶酶，法国LAFFORT 公司。

1.2 仪器与设备

恒温水浴锅，江苏科研仪器有限公司；生化培养箱，广东省医疗器械厂；7890A 气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦科技有限公司；HeraclesII快速气相电子鼻-气味分析仪，法国AlphaMOS 公司；IT-09A5 磁力搅拌器，上海一恒科学仪器有限公司；FA2004 电子天平，上海精密科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵工艺

1.3.1.1 发酵方式

果浆发酵：将柿子清洗沥干经机械破碎，得到柿子果浆（加入亚硫酸、果胶酶），调整柿子果浆的糖度和酸度，加入酵母发酵，发酵后去除果渣，将柿子果浆酒澄清、除菌过滤、装瓶储藏。

清汁发酵：将柿子清洗沥干经机械破碎，得到柿子果浆（加入亚硫酸、果胶酶），将柿子果浆挤压过滤得到柿子清汁，调整柿子清汁的糖度和酸度，加入酵母发酵，发酵结束后终止发酵，将柿子清汁酒澄清、除菌过滤、装瓶储藏。

皮渣发酵：将柿子清汁制作过程中的柿子皮渣放入发酵罐，调整柿子皮渣的糖度和酸度，加入酵母发酵，发酵结束后去除果渣，将柿子皮渣酒澄清、除菌过滤、装瓶储藏。

1.3.1.2 发酵方式的选择

以SY 安琪酵母为发酵菌种，用白砂糖调整糖度为200 g/L，酒石酸调整酸度为7.5 g/L，在20 ℃条件下发酵，然后对不同发酵方式生产的柿子酒进行理化分析与感官评定，选择合适的发酵方式。

1.3.2 HeraclesⅡ快速气相电子鼻-气味分析仪的

程序设置及方法[11]

1.3.2.1 常规参数

柱温箱温度40 ℃，进样口温度200 ℃，进样口压力25.0 kPa，进样口流量10.0 mL/min，阀温度250 ℃，捕集阱温度40 ℃，检测器温度250 ℃，分流10.0 mL/min，柱压80.0 kPa。

1.3.2.2 试验参数

初始条件：初始炉温为50 ℃，以3 ℃/s 的速度升温至250 ℃，数据采集时间为110 s，数据采集周期为0.01 s。

1.3.2.3 进样前处理方法及进样方式

将装有5 mL待测酒样的顶空瓶置于恒温水浴锅中，40 ℃下平衡10 min，在顶空瓶中抽取500 μL 气体，手动进样。每个样品进行5 次平行试验。

1.3.3 顶空固相微萃取-气相色谱/质谱联用（HS

SPME-GC/MS）试验

1.3.3.1 顶空固相微萃取[12]

将10 mL 酒样置于装有磁力搅拌器的顶空瓶（15 mL）中，加3 g NaCl，加盖封口，平衡30 min。将PDMS 纤维头插入顶空瓶，37 ℃恒温水浴锅中萃取30 min，然后将PDMS 纤维头插入进样口，在270 ℃下解析10 min，进行数据采集分析。

1.3.3.2 气相色谱条件[13]

N-NOWAX 柱（60 mm×0.25 mm×0.25 μm），程序升温：在初始温度40 ℃下维持10 min，然后以5 ℃/min 的升温速度将温度升至260 ℃并维持5 min，FID 检测器温度为260 ℃，进样口温度为250 ℃，载气为He，流量1 mL/min，不分流进样，GC 运行时间约为50 min。

1.3.3.3 质谱条件

EI 电离源，电离电压为70 eV，离子源温度为230 ℃，扫描范围为30～500 u。

1.3.4 柿子酒感官评价

参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》和GB/T10220—2012《感官分析方法学总论》制定柿子果酒感官评分标准，见表1。

表1 柿子果酒感官评分标准

2 结果与分析

2.1 不同发酵方式柿子酒挥发性香气成分分析

2.1.1 电子鼻对不同发酵方式柿子酒进行主成分分析[14]

由图1 可知，第一主成分对数据信息贡献率为99.751%，第二主成分贡献率为0.149%，两个主成分的总贡献率为99.900%，表明此图谱能够较好地反应所测样品中气味数据的完整性。识别指数为92，在80～100 之间，表示该数据区分分析结果为有效结果，识别指数值越大，区分效果越佳。

图1 不同发酵方式柿子酒的主成分分析

由图2 可知，3 种原料的样本之间有差异，其中果浆发酵与清汁发酵、皮渣发酵的柿子酒相对气味距离均较远，差异较大；清汁发酵、皮渣发酵的柿子酒气味距离相对较近，差异较小。在对柿果加工过程中，柿果中部分成分会被挤压过滤出去，导致果浆发酵与清汁发酵、皮渣发酵相比，气味差距稍大。

图2 不同发酵方式柿子酒的主成分分析三维图

2.1.2 电子鼻对不同发酵方式柿子酒进行判别因子分析

由图3 可知，第一区分指数达到89.44%，第二区分指数达到10.56%，二者累计区分指数合计达到100%，说明判别因子分析能够更好地显示3种发酵方式柿子酒间的差异。从图3 还可以看出，皮渣发酵和清汁发酵的香气成分差异较小，果浆发酵与皮渣发酵和清汁发酵样品间的香气成分差异较大。

图3 不同发酵方式的柿子酒的判别因子分析

2.1.3 电子鼻对不同发酵方式柿子酒挥发性香气成分的定性分析

由表2 可知，3 种发酵方式柿子酒的香气成分中大部分化合物都有存在，其中，醇类、酯类等分子量较小的挥发性物质占绝大多数。皮渣发酵、清汁发酵、果浆发酵柿子酒的香气成分中醇类和酯类分别约占50%、52%和46%。3 种方式发酵柿子酒香气成分中都含有3-戊醇（果香味）、乙酸丙酯（梨和草莓样果香）、辛醇（强烈的柑橘香气）、己酸丁酯（特有的菠萝香气），使柿子酒增添了独特风味。皮渣发酵中含有β-紫罗酮（紫罗兰、甜果香），清汁发酵中含有正壬基苯和磷酸三丁酯，果浆发酵中含有丙二醇甲醚，表示不同发酵方式柿子酒的香气成分存在差异。

表2 不同发酵方式柿子酒中可能的风味信息

续表

2.1.4 气相-质谱联用分析不同发酵方式柿子酒的香气成分

由表3 可知，异戊醇（苹果白兰地香气、辛辣味）、正己醇（草本植物、青草味）、丁二酸二乙酯（愉快气味）、乙酸异丁酯（柔和水果酯香味）等是柿子酒香气成分中相对峰面积最高的物质，为柿子酒香气成分中的主要成分。

表3 不同发酵方式的柿子酒样香气成分的GC-MS分析结果

续表

由图4 可知，3 种发酵方式柿子酒的香气成分大部分为醇类、酯类、醛类，醇类是柿子酒香气的主要成分。皮渣发酵、清汁发酵、果浆发酵总醇类相对峰面积分别为39.62%、33.47%、45.32%，其中异戊醇相对峰面积最高，分别为32.03%、32.03%、29.32%。皮渣发酵、清汁发酵、果浆发酵总酯类相对峰面积分别为2.79%、21.65%、3.53%，其中丁二酸二乙酯相对峰面积最高，分别为1.18%、0.04%、1.39%。皮渣发酵、清汁发酵、果浆发酵总醛类相对峰面积分别为 12.56%、0.00%、7.97%，其中缩醛相对峰面积最高，分别为12.43%、0.00%、7.85%。酸类、烷类、酚类和其他类物质含量较低，对酒的香气起重要的修饰作用。清汁发酵柿子酒香气成分中酯类数量最多，为27 种，果浆发酵次之。清汁发酵的柿子酒香气更浓郁，具有典型性。

图4 柿子酒中香气物质分类

2.1.5 不同发酵方式柿子酒的感官分析

由图5 可知，根据柿子果酒感官评分标准，对3 种发酵方式柿子酒进行感官评价[15]。研究发现，清汁发酵柿子酒香气得分与皮渣发酵比较接近，在柿子压榨过程中香气成分有所损失，与电子鼻检测结果相同。清汁发酵柿子酒综合感官评分大于果浆发酵和皮渣发酵柿子酒，与气相-质谱检测到清汁发酵柿子酒香气成分较多的结果相同。

图5 不同发酵方式的柿子酒感官评价雷达图

2.2 主成分分析

用SPSS 软件对表3 中的数据进行主成分分析，得到两个主成分，如表4 所示。其中第一主成分贡献率为59.027%、第二主成分贡献率为40.973%。

表4 主成分分析中解释的总方差

由表5 表明，因子载荷量＞0.950 的物质共有89 种，在第一主成分中有48 种，其中有35 种在清汁发酵的样品中检测出，有25 种在皮渣发酵的样品中检测出，有23 种在果浆发酵的样品中检测出。第二主成分中有30 种，其中有26 种在皮渣发酵的样品中检测出，有6 种在清汁发酵的样品中检测出，有6 种在果浆发酵的样品中检测出。

表5 成分矩阵

主成分分析可知，主成分为两类香气，一类香气在皮渣发酵酒和果浆发酵酒中基本一致，主要为缩醛、丁二酸二乙酯、3-羟基-2-丁酮，相比于果浆发酵，皮渣发酵酒的缩醛成分更高；清汁发酵酒的主要香气成分为乙酸异戊酯、2-糠酸乙酯、乳酸乙酯。二类香气在皮渣发酵酒中种类最多、含量最高，主要为2-甲基丁醇，清汁发酵和果浆发酵酒的香气成分种类相同，主要成分为S-（-）-2-甲基-1-丁醇，但其在果浆发酵酒中含量远高于清汁发酵。

一类香气在皮渣发酵酒和果浆发酵酒中的含量分别为16.37%和11.99%，且种类相近，而清汁发酵酒香气物质含量为22.49%。因此，一类主成分在皮渣发酵酒和果浆发酵酒中基本相同，和清汁发酵酒对比明显。二类香气在皮渣发酵酒和果浆发酵酒中的含量分别为8.06%和6.59%，在清汁发酵酒中的含量仅为0.97%，对比结果与一类主成分类似。

如表6 所示，一类香气在皮渣发酵、清汁发酵、果浆发酵酒中体积占比分别为16.37%、22.49%和11.99%，其中皮渣发酵缩醛占比12.43%，丁二酸二乙脂占比1.18%；清汁发酵乙酸异戊酯占比12.43%，2-糠酸乙酯占比6.76%；果浆发酵缩醛占比7.85%，丁二酸二乙脂占比1.39%。二类香气在皮渣发酵、清汁发酵、果浆发酵酒中体积占比分别为8.06%、0.97%和6.59%。其中皮渣发酵2-甲基丁醇占比6.76%，清汁发酵S-（-）-2-甲基-1-丁醇占比0.87%，果浆发酵S-（-）-2-甲基-1-丁醇占比6.39%。通过对比成分一和成分二得知，皮渣发酵酒的香气物质种类最多，清汁发酵酒的香气成分以成分一为主，果浆发酵酒的香气种类和含量较少。3 类不同发酵方式的柿子酒中，皮渣发酵和果浆发酵的香气成分具有相关性，清汁发酵的香气成分和另外2 种发酵酒的香气成分具有很大差别。

表6 各类香气物质占比

3 结论

利用电子鼻、气相-质谱联用及感官评价3 种技术从不同方面对柿子酒挥发性香气成分进行了检测和评价。

3.1 电子鼻对不同发酵方式柿子酒挥发性香气成分分析

通过电子鼻主成分分析和判别因子分析发现，清汁发酵与皮渣发酵柿子酒中挥发性香气成分差异较小，与果浆发酵柿子酒中挥发性香气成分差异较大。通过电子鼻定性分析，清汁发酵、皮渣发酵、果浆发酵柿子酒香气成分中，醇类酯类分别约占52%、50%和46%。3 种方式发酵柿子酒香气成分中都含有3-戊醇（果香味）、乙酸丙酯（梨和草莓样果香）、辛醇（强烈的柑橘香气）、己酸丁酯（特有的菠萝香气），为柿子酒增加了独特风味。

3.2 气相-质谱联用对不同发酵方式柿子酒挥发性香气成分分析

通过气相-质谱联用对不同发酵方式柿子酒挥发性香气成分分析可知，异戊醇、正己醇、乙酸异丁酯等物质相对峰面积最大，是柿子酒香气成分中的主要成分。清汁发酵柿子酒挥发性香气成分中脂类数量多，为27 种，果浆发酵次之。因此，清汁发酵的柿子酒酒香更浓郁，更具典型性，感官得分最高。

3.3 柿子酒中主要香气成分

皮渣发酵柿子酒主要香气物质为缩醛、丁二酸二乙酯、3-羟基-2-丁酮、2-甲基丁醇。清汁发酵柿子酒主要香气成分为乙酸异戊酯、2-糠酸乙酯、乳酸乙酯、S-（-）-2-甲基-1-丁醇。果浆发酵柿子酒主要香气物质为缩醛、丁二酸二乙酯、3-羟基-2-丁酮、S-（-）-2-甲基-1-丁醇。