黄芪甲苷对力竭运动大鼠心肌损伤及炎症反应的影响

王冠锦,赵 暘

(1. 北京体育大学 研究生院，北京 100084；2. 北京交通大学 体育教学部，北京 100044)

运动锻炼能够降低常见慢性病如各类癌症、心脑血管疾病及2型糖尿病的发病率，对健康的维护及促进具有重要意义。然而，反复的力竭运动可以引起机体发生炎症反应，具体表现为促炎因子及炎性介质表达增加，进而对心脏、肝脏及肾脏等组织造成较大损伤。如何控制力竭运动后的脏器组织损伤及炎症反应一直是人们关注的热点。

黄芪甲苷为羊毛脂醇型四环三萜类皂苷，是黄芪的主要功效成分之一，具有提高免疫能力、抑制病毒增殖、降低氧化应激水平及下调炎症因子表达等多种生物活性。研究发现，黄芪甲苷可以通过抗炎、抑制细胞凋亡、降低细胞毒性、平衡细胞内钙稳态及调节心肌能量代谢等途径发挥保护心脏损伤作用。目前为止，在力竭运动导致的心肌损伤模型中，黄芪甲苷能否同样起到保护作用尚未可知。基于此，本研究拟建立反复力竭运动大鼠模型，灌胃给予黄芪甲苷后，探讨其对心肌损伤是否具有保护作用，并进一步明确该作用与炎症反应及相关信号通路的联系，初步分析保护作用的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂与仪器

黄芪甲苷(含量>98%)购于成都瑞芬思德丹科技公司；H-E染色试剂盒(上海通蔚公司)； iNOS、NO、IL-1β、IL-6、IL-10及TNF-α检测试剂盒(武汉赛培公司)；TLR4、MyD88及NF-κBp65及β-actin等一抗(美国Abcam公司)；对应二抗，购于北京Sino公司。电子天平(AE100型)，瑞士Metter公司；动物跑步机(FT-201型)，成都泰盟科技公司；光学显微镜(型号：ZX-201HC ZX-200HC，深圳众寻仪器公司)；全自动生化分析仪(型号：NVAS6801，山东诺安诺泰信息系统公司)；酶标仪(型号：SHE-3000，北京赛尔福科技公司)；蛋白电泳仪(型号：1703940型，美国伯乐公司)。

1.2 分组、药物干预及训练方案

成年健康雄性SD大鼠，清洁级，由北京科兴中维公司提供，生产许可证：SYXK(京)2020-0054。适应环境后，将40只大鼠分为对照组、运动模型组、运动模型+低剂量黄芪甲苷组(100 mg/kg)及运动模型+高剂量黄芪甲苷组(200 mg/kg)，每组10只。开始运动训练时即给予药物干预，运动训练在每天上午进行，并于训练结束2 h后药物干预；给药剂量参考魏斓等的研究并结合预实验结果，给药方式为灌胃给药，给药频率为1次/d。对照组不给予运动训练，其他操作相同；剩余各组均需给予运动训练，训练方案参照徐祖杰等的研究。大鼠首先用20 m/min的速度在跑步机上(坡度0°)跑步0.5 h，每天运动1次，训练6 d后休息1 d，此过程共训练1周；随后调整坡度为5°，用30 m/min速度跑步，力竭时停止，每天运动1次，训练6 d后休息1 d，此过程连续训练6周。

1.3 血液及心脏组织取材

各组大鼠于6周训练结束并末次灌胃黄芪甲苷后，禁食24 h。用3 mL/kg乌拉坦溶液(20%)麻醉大鼠，腹主动脉取血，离心制备血清，-80 ℃冰箱保存备用。取血后，分离心脏，取相同部位心肌组织，在4%多聚甲醛溶液中保存固定，剩余心肌组织在-80 ℃冰箱中保存备用。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 心肌组织病理变化 制作石蜡切片后，常规方法进行H-E染色，封片晾干后，显微镜下检测心肌组织病理变化。

1.4.2 心肌损伤指标 CK、CK-MB、LDH及AST活性等心肌损伤指标检测采用全自动生化分析仪进行。

1.4.3 炎症反应指标 心肌组织加入适量裂解液，电动匀浆机匀浆后，在冰水浴中裂解30 min，离心制备10%心肌组织匀浆液。参照试剂盒说明书指南进行操作，在450 nm波长处测吸光度，根据标准曲线分别计算各组大鼠心肌组织iNOS活性及NO、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α含量。

1.4.4 心肌组织相关蛋白表达 按照“1.4.3”中的方法，制备10%心肌组织匀浆液，通过Western blot法检测心肌组织相关蛋白表达，其中TLR4、MyD88、NF-κBp65的稀释比例为1∶1 000，β-actin的稀释比例为1∶2 500，二抗的稀释比例为1∶5 000。抗体结合后滴加ECL试剂显色，用Image J1.8.0软件进行灰度值分析。

1.5 数据处理

结果以“平均值±标准差”表示，采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析，<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 对心肌组织病理变化的影响

由图1可见，对照组大鼠心肌细胞无炎性浸润现象发生，心肌纤维紧密且排列整齐，相互连接成网状。运动模型组大鼠心肌细胞发生较多炎性浸润现象，心肌纤维肿胀，损伤较严重。运动模型+低剂量黄芪甲苷组、运动模型+高剂量黄芪甲苷组大鼠心肌组织出现少许炎性细胞浸润，心肌纤维肿胀及损伤程度有所缓解，其中运动模型+高剂量黄芪甲苷组改善更为明显。

图1 黄芪甲苷对力竭运动大鼠心肌组织病理变化的影响(200×)Fig. 1 Effects of astragaloside IV on pathological changes of myocardium in exhaustive exercise rats (200×)

2.2 对心肌损伤标志物的影响

由表1可见，运动模型组大鼠CK、CK-MB、LDH及AST活性与对照组比较均显著升高(<0.05)；低、高剂量黄芪甲苷能够显著降低运动模型大鼠CK、CK-MB、LDH及AST活性(<0.05)；运动模型+高剂量黄芪甲苷组大鼠CK、CK-MB及AST活性与运动模型+低剂量黄芪甲苷组比较进一步降低(<0.05)，而LDH活性无显著变化(>0.05)。

表1 黄芪甲苷对力竭运动大鼠心肌损伤标志物的影响Table 1 Effects of astragaloside IV on myocardial injury markers in exhaustive exercise rats U/L

2.3 对iNOS活性及NO含量的影响

由表2可见，运动模型组大鼠iNOS活性及NO含量与对照组比较均显著升高(<0.05)；低、高剂量黄芪甲苷可以显著使运动模型大鼠iNOS活性及NO含量降低(<0.05)；高剂量黄芪甲苷降低运动模型大鼠iNOS活性及NO含量的能力显著优于低剂量黄芪甲苷(<0.05)。

表2 黄芪甲苷对力竭运动大鼠iNOS活性及NO含量的影响Table 2 Effects of astragaloside IV on iNOS activity and NO content of rats in exhaustive exercise rats

2.4 对IL-1β、IL-6、IL-10及TNF-α含量的影响

由表3可见，运动模型组大鼠IL-1β、IL-6及TNF-α含量与对照组比较均显著升高(<0.05)，而IL-10含量显著降低(<0.05)；低、高剂量黄芪甲苷均能够显著降低运动模型大鼠IL-1β、IL-6及TNF-α含量(<0.05)，同时显著升高IL-10含量(<0.05)；运动模型+高剂量黄芪甲苷组大鼠IL-1β、IL-6及TNF-α含量降低及IL-10含量升高的幅度均显著高于运动模型+低剂量黄芪甲苷组(<0.05)。

表3 黄芪甲苷对力竭运动大鼠IL-1β、IL-6、IL-10及TNF-α含量的影响Table 3 Effects of astragaloside IV on IL-1β, IL-6, IL-10 and TNF-α contents of rats in exhaustive exercise rats pg/mgpro

2.5 对TLR4/MyD88/NF-κB通路的影响

由图2及表4可见，运动模型组大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白TLR4、MyD88及NF-κBp65表达与对照组比较均显著升高(<0.05)；低、高剂量黄芪甲苷均可以显著降低运动模型大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白TLR4、MyD88及NF-κBp65表达(<0.05)，且运动模型+高剂量黄芪甲苷组比运动模型+低剂量黄芪甲苷组相关蛋白下降幅度更为显著(<0.05)。

图2 Western blot法检测黄芪甲苷对力竭运动大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路的影响Fig. 2 Effects of astragaloside IV on TLR4/MyD88/NF-κB pathway in exhaustive exercise rats detected by Western blot assay

3 讨 论

适量的运动可增强心脏功能，加快机体新陈代谢，而过度的运动会引起心脏负荷增加，导致心肌组织损伤。已有研究表明，强负荷体育训练或力竭运动均会使血清中心肌损伤标志物CK、CK-MB、LDH及AST等活性增加。在本研究中，运动模型组大鼠心肌组织出现病理改变，且血清CK、CK-MB、LDH及AST活性均显著升高，提示建模成功；运动模型+低剂量黄芪甲苷组、运动模型+高剂量黄芪甲苷组大鼠心肌组织病理改变有一定程度的缓解，同时，血清CK、CK-MB、LDH及AST活性均显著降低，表明黄芪甲苷对力竭运动大鼠心肌损伤具有保护作用。

表4 黄芪甲苷对力竭运动大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路的影响Table 4 Effects of astragaloside IV on TLR4/MyD88/NF-κB pathway in exhaustive exercise rats β-actin

NO被认为具有强大的血管扩张作用，同时也是重要的炎症介质，NO的生成依赖于iNOS的催化。研究发现，给予牡蛎多糖或黄精多糖干预后，由高强度训练或力竭运动引起的机体组织iNOS活性及NO含量增加的趋势会被有效控制，进而通过抑制炎症反应减弱相关脏器损伤。在炎症反应中炎症因子的表达具有重要意义，在生理条件下，体内的促炎因子与抗炎因子保持动态平衡；而在病理或反复力竭运动中，该平衡被打破，从而引发炎症反应。IL-1β、IL-6及TNF-α为促炎因子，可以促进炎症反应的发生，而IL-10则属于抗炎因子，其作用为抑制炎症反应。岑人军等研究证实，北五味子乙素对力竭运动大鼠心肌损伤的保护作用，与抑制IL-6、TNF-α表达及促进IL-10表达有关。本研究结果同样证实，运动模型+低剂量黄芪甲苷组、运动模型+高剂量黄芪甲苷组大鼠iNOS活性及NO、IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著降低，而IL-10含量显著升高，提示抑制炎症反应是黄芪甲苷发挥保护心肌损伤的潜在原因。

TLR4/MyD88/NF-κB通路是机体经典的炎症信号通路，其中TLR4为心脏组织中表达量最高的TLR家族成员，在心脏炎症和损伤过程中发挥重要作用。TLR4被激活后可与MyD88蛋白结合，促进NF-κB蛋白的表达，启动IL-1β、IL-6及TNF-α等炎症因子的转录，引起组织损伤。Rosa等研究发现，大鼠在力竭运动后，脂肪组织中促炎因子的增加与TLR4/MyD88/NF-κB通路有关。此外，相关研究证实，在急性心肌梗死模型中，黄芪甲苷可有效降低TLR4、MyD88、NF-κBp65的过表达，从而改善急性心肌梗死程度。本研究结果同样发现，在力竭运动后心肌组织TLR4/MyD88/NF-κB通路处于活化状态，经黄芪甲苷干预后，TLR4、MyD88及NF-κBp65蛋白表达水平显著降低，提示黄芪甲苷对力竭运动大鼠心肌损伤的保护作用与抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路有关。

4 结 论

黄芪甲苷具有抑制力竭运动大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路及炎症反应作用，该作用是其保护心肌损伤的潜在原因，说明其在防治运动引起的心肌损伤中具有一定的应用前景。