基于网络药理学-分子对接技术研究贞芪扶正颗粒治疗大肠癌相关性疲乏的作用机制

程艳野，习弯弯，毛雪杨，魏天怡，胡海瑞，李志刚*

(1．河南中医药大学，河南 郑州 450046；2．河南中医药大学第三附属医院，河南郑州450008)

大肠癌(colorectal cancer，CRC)包括直肠癌和结肠癌，其2020年新发病例数位居世界第3位，死亡病例数居第2位[1]。治疗方式主要有手术、放化疗等，在其发病及治疗过程中癌因性疲乏(cancer-related fatigue，CRF)是较为常见的症状之一[2]。癌因性疲乏是指某种痛苦的、持久的、主观的、有身体、情感及意识方面的疲乏感，与近期活动量不符，与肿瘤患者相关，而且妨害日常生活[3]。根据其特点，可将其归属于中医“虚劳”范畴，临床研究表明中医药可以作为癌因性疲乏的补充甚至替代治疗[4]。2020年中成药治疗癌因性疲乏临床应用指南指出贞芪扶正颗粒可以有效改善大肠癌根治术后患者疲乏状态，并得到专家共识[4]。贞芪扶正颗粒由黄芪、女贞子组成，具有提高人体免疫功能，适应于各种疾病引起的虚损，可配合手术、放射线、化疗使用，但其治疗大肠癌相关性疲乏中的作用机制尚不明确。因此，本研究拟通过网络药理学-分子对接方法探讨贞芪扶正颗粒治疗大肠癌相关性疲乏的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 贞芪扶正颗粒靶点筛选

以“女贞子”“黄芪”为关键词，依次检索中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)收集药物活性成分，筛选出药物口服生物利用度≥30%、药物相似性≥0.18的有效活性成分及其作用的蛋白质靶点[5]，然后通过Uniprot蛋白质数据库(https://www.uniprot.org)规范蛋白质靶点信息。

1.2 大肠癌相关性疲乏的靶点筛选

以“Colorectal cancer-related fatigue”为关键词，挖掘GeneCards(https://www.genecards.org)、OMIM(http://www.omim.org)等数据库中大肠癌相关性疲乏的潜在靶点，在GeneCards数据库中，如果靶点过多则设定Score≥5的目标靶点为潜在靶点，结合其他数据库补充相关靶点，合并后删除重复值。

1.3 贞芪扶正颗粒-大肠癌相关性疲乏的PPI网络构建及重要靶点筛选

为明晰芪贞扶正颗粒药物相关靶点与大肠癌相关性疲乏靶点间的相互作用，使用Hiplot(https://hiplot.com.cn)平台将药物潜在作用的靶点基因同疾病基因进行匹配并绘制韦恩图，得到交集靶点，并上传至String 11.0数据库(https://string-db.org)构建蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络模型，将生物种类设定为“Homo sapiens”，最小相互作用设定为≥0.4，得到PPI网络。然后通过CytoScape 3.7.2中的MCODE插件对其进一步分析，获得该网络中关键模块，删选出结果中同时大于节点度值分布(node degree distribution)、介数中心性(betweenness centrality)、接近中心性(closeness centrality)三者中位数的靶点，为该PPI网络中的核心靶点。

1.4 GO生物分析与KEGG通路富集分析

将交集靶点上传至Metascape平台(http://metascape.org/gp/index.html)里的基因列表中，选定物种“homo sapiens”，设置P＜0.01，进行GO功能分析和KEGG通路富集分析，依据靶点富集程度进行降序，筛选排名靠前的生物过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular components，CC)、分 子 功 能(molecular function，MF)和通路，并通过微生信平台对其可视化。

1.5 贞芪扶正颗粒成分-大肠癌相关性疲乏靶点-通路网络图的构建

运用CytoScape 3.7.2构建贞芪扶正颗粒成分-大肠癌相关性疲乏靶点-通路网络图，将活性成分根据其度值排序，筛选出排名靠前的有效成分为关键成分，可供分子对接用。

1.6 分子对接验证

从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载1.5筛选出的关键化合物的2D结构的sdf格式文件，通过OpenBabel转换为mol2格式，导入AutoDockTools 1.5.6软件中，检查其空间结构无误后，将其添加原子电荷，分配原子类型，所有柔性键均改为默认可旋转并保存为pdbqt格式，作为对接配体。选取前4位1.3筛选出的核心靶点，于Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)寻找活性成分的3D构想，将查询的PDBID输入PDB数据库(https://www.rcsb.org/)中并下载其相应蛋白的3D结构的pdb格式。将此3D结构导入AutoDockTools 1.5.6软件中，进行去除水分子、加氢、加电荷及各项优化，然后设置网格箱(gird box)为默认值并将其保存，最后将优化后的蛋白保存为pdbqt格式，作为对接受体。根据靶蛋白中配体的坐标以及靶蛋白活性口袋(gird box中数据)进行设置，采用AutoDock Vina1.1.2进行分子对接并得到结果，将结果导入PyMOL软件中进行可视化。

2 结果

2.1 芪贞扶正颗粒活性成分靶点的获取

初步提取女贞子化学成分119种、黄芪化学成分87种，经药物口服生物利用度、药物相似性值筛选后共获得黄芪20个，女贞子13个活性成分，见表1。女贞子成分作用靶点321个、黄芪成分作用靶点349个，合并后删除重复值共得到靶点209个。

表1 贞芪扶正颗粒主要成分

2.2 大肠癌相关性疲乏靶点的获取

从GeneCards数据库获得大肠癌相关性疲乏靶点2 330个。根据经验设定Score大于中位数的目标靶点为大肠癌相关性疲乏的潜在靶点，如通过GeneCards所得大肠癌相关疲乏靶点Score最大值为116.57，最小值为0.35，取Score≥5.0的靶点为大肠癌相关性疲乏的潜在靶点。结合OMIM、TTD、DRUGBANK数据库补充相关靶点，合并后删除重复值，最终得到975个大肠癌相关性疲乏相关靶点。

2.3 贞芪扶正颗粒-大肠癌相关性疲乏PPI网络的构建及核心靶点

将筛选的贞芪扶正颗粒活性成分靶点与大肠癌相关性疲乏疾病靶点取交集，绘制韦恩图见图1，得到贞芪扶正颗粒-大肠癌相关性疲乏共同靶点111个。进而将靶点提交至String 11.0平台，得到一个111个节点，2 412条边的PPI网络，下载tsv格式，导入Cytoscope 3.7.2软件中进行可视化，见图2。经MCODE分析后得出4个模块，排除Score小于10的模块，得到1个模块。通过NetworkAnalyzer工具对该网络分析，筛选出节点度值、介数中心性、接近中心性均大于中值的靶点，得到29个核心靶点见表2。

图1 贞芪扶正颗粒-大肠癌相关性疲乏韦恩图

图2 贞芪扶正颗粒治疗大肠癌相关性疲乏相关靶点蛋白互作图

表2 核心靶点信息

2.4 GO生物分析与KEGG通路富集分析

将交集靶点导入Metascape平台进行GO分析和KEGG通路分析，KEGG通路分析见图3，主要有癌症的通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、细胞衰老等通路，具体靶点通路富集结果见表3，说明贞芪扶正颗粒的活性成分靶点分布于多条通路，各通路协调治疗大肠癌相关性疲乏。

表3 贞芪扶正颗粒治疗大肠癌相关性疲乏靶点通路富集结果

图3 贞芪扶正颗粒治疗大肠癌相关性疲乏的KEGG富集分析

GO分析结果见图4，生物过程主要涉及到对无机物质的反应、对外源刺激的反应、细胞迁移的正调控等方面；细胞组分主要涉及到膜筏、膜微域、转录调节复合物等位置；分子功能主要涉及到蛋白激酶活性、磷酸转移酶活性、激酶活性等过程。

图4 贞芪扶正颗粒治疗大肠癌相关性疲乏的GO富集分析

2.5 贞芪扶正颗粒成分-大肠癌相关性疲乏靶点-通路网络图的构建

应用CytoScape 3.7.2构建贞芪扶正颗粒成分-大肠癌相关性疲乏靶点-通路网络见图5。网络中节点度值较高的前5个药物成分槲皮素(节点度值100)、木犀草素(节点度值46)、山柰酚(节点度值32)、β-谷甾醇(节点度值14)、毛蕊异黄酮(节点度值14)，可能为发挥治疗作用的关键成分，对其进行分子对接。

图5 贞芪扶正颗粒有效成分-靶点-通路网络

2.6 分子对接结果

选取核心靶点AKT1、JUN、MMP9、VEGFA与贞芪扶正颗粒中槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、毛蕊异黄酮活性成分进行分子对接。结合能＜0表示化合物与蛋白有结合能力，结合能＜-5.0 kcal/mol表示化合物与蛋白结合良好，结合能＜-7.0 kcal/mol表示化合物与蛋白结合能力极好[6]。分子对接结果见表4，显示JUN与山柰酚、JUN与毛蕊异黄酮、JUN与木犀草素、MMP9与木犀草素之间有较强的结合力。利用PyMOL将配体中结合能最强的成分与靶点绘制成分与靶点对接模式图见图6，山柰酚与靶点JUN的ARG-155、DC-5009形成氢键，毛蕊异黄酮与靶点JUN的PRO-418形成氢键，木犀草素与靶点JUN的GLU-568、GLN-671形成氢键，与靶点MMP9的TYR-420形成氢键。

图6 成分-靶点对接相互作用模式

表4 贞芪扶正颗粒关键活性成分与核心靶点的分子对接结果

3 讨论

2020年癌因性疲乏欧洲肿瘤内科学会(European Society of Oncology Medicine，ESMO)指南指出，有65%的肿瘤患者伴随CRF，在放疗或化疗期间疲乏发生率为80%～90%，严重影响患者的生存质量[7]。其病因及发病机制尚不明确，病因可能与肿瘤本身、肿瘤相关治疗、并发症、社会心理因素等相关，机制可能与细胞因子失调、下丘脑调节回路损坏、5-羟色胺(5-HT)失调、线粒体和肌肉失调、基因多态性等有关[8]。研究表明大肠癌患者在进行手术、化疗治疗后，普遍存在CRF[9-10]。贞芪扶正颗粒组方中黄芪为补药之长，补气固表；女贞子扶正固本、滋补肝肾，两药合用加强益气健脾、滋阴补肾效果。现代药理学研究黄芪主要有多糖类、皂苷类、黄酮类等化学成分，具有提高免疫力、抗衰老、抗肿瘤等药理作用[11]；女贞子含三萜类、环烯醚萜类、苯乙醇苷类及黄酮类等化学成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎镇痛等活性[12]。张殿宝等[13]通过观察120例大肠癌术后CRF患者，发现贞芪扶正颗粒可明显降低疲乏量表评分，提高机体免疫功能，改善疲乏症状。本次研究通过网络药理学研究发现贞芪扶正颗粒作用机制可能有以下几方面。

3.1 促进肿瘤细胞的凋亡

CRF可直接由恶性肿瘤产生并成为其直接症状[14]，本次研究中核心成分槲皮素可以使结肠癌大鼠caspase-3在内的凋亡基因表达增加，Bcl-2等抗凋亡基因表达减少，促进结肠癌细胞的凋亡[15]。木犀草素阻断人体大肠癌HCT116细胞的细胞转化，还可刺激奥沙利铂处理的大肠癌细胞的增殖[16]。山奈酚促进了大肠癌HCT116和HCT15细胞中PARP的裂解和半胱氨酸蛋白酶caspase-8、-9、-3、磷酸化p38MAPK、p53、p21的激活[17]。毛蕊异黄酮可通过ERβ介导的EGFR-P13K-Akt/EGFR-MAPKs通路抑制结肠癌HCT116和HT29细胞的增殖并诱导其凋亡[18]。核心靶点AKT1激酶在肿瘤从生长演变为恶性转移的过程中发挥重要作用[19]。JUN与CRC细胞中的USP28启动子结合，USP28可以稳定ZNF304蛋白，该蛋白在KRAS突变的CRC患者中标记一些抑制肿瘤生长的基因，使其关闭[20]。KEGG分析显示贞芪扶正颗粒治疗大肠癌相关性疲乏的通路以癌症的通路为主，有60个靶点作用于该通路。在一项观察贞芪扶正颗粒对结直肠癌肿瘤生长的研究中，发现贞芪扶正颗粒可以减小结直肠癌模型小鼠肠内肿瘤的尺寸及数量[21]。

3.2 改善线粒体和肌肉功能

患有慢性应激的癌症患者在体内会不断产生氧化应激反应，从而在组织细胞中产生大量活性氧[22]，使线粒体呼吸和能量供应减少，损害人体正常的有氧代谢和肌肉耐力，导致CRF的产生。核心成分槲皮素可以直接清除活性氧，也可以间接诱导超氧化物歧化酶产生谷胱甘肽，作为氢供体与结合，转化为H2O2；同时调节非酶依赖性抗氧化防御系统途径，导致活性氧水平降低[23]。木犀草素可以激活Nrf2/ARE信号通路降低活性氧[24]。研究表明贞芪扶正颗粒能够提高超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽过氧化物GSH-Px水平，降低活性氧含量[25]。

3.3 调节细胞因子

肿瘤细胞释放的炎症细胞因子，在影响正常细胞代谢的同时，也刺激癌细胞生长，造成了机体机能下降，产生疲乏[14]。结直肠癌引发的遗传损伤，使屏障恶化导致微生物产物侵入腺瘤，产生肿瘤引发的炎症[26]。炎症因子可激活诱导下丘脑—垂体—肾上腺(HPA)轴，释放皮质类固醇激素增多促进机体的炎症反应，导致疲乏的产生[27]。某些炎性因子如IL-6、TNF-α与5-HT构成反馈环路，5-HT可抑制炎性因子合成，当炎性因子合成增加时，会使5-HT的释放增加，癌症病人长期处于病理状态，机体反馈环路已经紊乱，炎性因子的合成不受抑制，刺激5-HT的释放，产生疲乏，同时5-HT水平会破坏HPA轴[28-29]。贞芪扶正核心成分槲皮素具有抗炎能力，可抑制CRC患者促肿瘤坏死因子TNF-α的释放[30]。β-谷甾醇使细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8生成减少，机制是抑制表皮细胞、巨噬细胞中炎症小体NLRP3的激活，从而抑制CAS1产生及MAPK信号通路活化[31]。说明贞芪扶正颗粒可以通过直接抗炎、间接调控HPA轴，降低5-HT水平，改善疲乏状态。核心靶点MMP9由于其蛋白水解活性，通过调节癌细胞的迁移、上皮-间质转化和存活、诱导免疫应答、血管生成和肿瘤微环境的形成，在肿瘤发生中发挥关键作用[32]。VEGFA的减少可能与慢性疲劳综合征有关[33]。本次研究中细胞炎性因子、表皮生长因子受体EGFR均可刺激PI3K，进而催化细胞膜上3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)的产生，激活PI3K-AKT信号通路[34]。这与人参皂苷可以缓解老年大鼠疲劳综合征，其机制与激活PI3K-AKT信号通路有关的研究相符合[35]。

本研究证实贞芪扶正颗粒中槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、毛蕊异黄酮核心成分作用于AKT1、JUN、MMP9、VEGFA靶点激活癌症的通路、PI3K-AKT信号通路来治疗大肠癌相关性疲乏。证明了贞芪扶正颗粒治疗大肠癌相关性疲乏的多成分、多靶点、多通路的特点，为贞芪扶正颗粒治疗大肠癌相关性疲乏的机制研究及临床应用提供了依据。