维生素A对黄鳝生长、转氨酶活性和肝脏显微结构的影响

胡重华，张文平，霍欢欢，安雨琪，黄广华，梁立文，周磊涛，周秋白

（江西农业大学 动物科学技术学院/南昌市特色水生生物营养生理与健康养殖重点实验室，江西 南昌 330045）

【研究意义】维生素A 是一种脂溶性维生素，在动物的细胞分化和增殖、生长、视觉、应激、免疫、生殖、胚胎发育和健康维持等许多重要的生物过程中发挥着重要作用[1-3]。水产动物和其他动物一样，自身不能合成维生素A，需要依赖食物提供维生素A 或其前体—类胡萝卜素[4]。维生素A 缺乏或过量都会影响鱼类的健康及正常生长，导致鱼体出现维生素A 缺乏或中毒症状。饲料维生素A 缺乏时花鲈（Lateolabrax japonicus）[5]、尼罗罗非鱼幼鱼（Oreochromis niloticus）[6-7]、草鱼（Ctenopharyngodon idella）[8]及比目鱼（Hippoglossus hippoglossusL.）[9]表现出生长减缓、死亡率升高、眼球膨胀、鳍基和皮肤充血、鳃盖扭曲和脊柱歪曲等典型缺乏症状。维生素A过量会导致动物死亡率增加、脊椎生长异常和生长减缓等症状[7,10]。摄入高维生素A水平饲料时，牙鲆幼鱼[11-12]表现出生长受阻、体长变短及骨骼畸形等症状，虹鳟[13]、罗非鱼[7]和牙鲆[14]的肝脏表现出脆弱和苍白。【前人研究】目前，有关鱼类对饲料维生素A需求量的报道较多，如吉富罗非鱼（Oreochromis nilooticus）需求量2 954.84 IU/kg[15]、青鱼幼鱼（Mylopharyngodon piceus）需求量2 246.64 IU/kg[16]、黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）适宜添加水平为33 705～40 316 IU/kg[17]、武昌鱼幼鱼（Megalobrama amblycephala）需求量为3 914 IU/kg[18]、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）需求量为2 500～3 500 IU/kg[19]。鲤（Cyprinus carpio）需求量在4 000～20 000 IU/kg[20-21]，牙鲆（Paralichthys olivaceus）需求量在10 000 IU/kg以上[22]。【研究切入点】目前，有关黄鳝营养学研究已有较多报道，但主要集中在黄鳝蛋白质及脂肪需求方面[23-29]，有关维生素A的研究未见报道。【拟解决问题】本试验以（2.64±0.03）g 人工黄鳝苗为试验动物，探究饲料中维生素A 对黄鳝生长、血清生化指标及肝脏显微结构的影响，旨在探究黄鳝对饲料维生素A 的需求，以期为黄鳝人工饲料的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计及饲料

试验分为7组，每组4个重复，每个重复行50尾。试验所用黄鳝选自于江西农业大学水产养殖基地，均为人工繁殖黄鳝苗，平均体质量（2.64±0.03）g，从中筛选1 400尾规格整齐、体质健康、无病无伤的黄鳝用于试验。

本试验采用单因素试验设计，以鱼粉为主要饲料蛋白质源，维生素A 醋酸酯为维生素A 添加源，在7组相同基础饲料上分别添加维生素A 醋酸酯。添加量设置0～16 000 IU/kg，添加水平分别为：0，500，1 000，2 000，4 000，8 000，16 000 IU/kg（实测值：2 910，3 230，3 520，3840，5 020，7 030，11 800 IU/kg，编号为L1～L7）。试验所用维生素A醋酸酯（50万IU/kg）购买于上海麦克林生化科技有限公司。饲料鱼粉、豆粕购自江西大佑农生物科技有限公司，玉米蛋白粉及鸡肉粉购自浙江湖州海皇生物科技有限公司。所有饲料原料经80 目过筛[30]，按照配比（表1）将各原料充分混匀，加16%的水分后，经40 型单螺杆膨化机在温度为123～125 ℃下制成粒径为1.5～2.1 mm 的条状膨化饲料，避光风干后，自封袋密封保存于阴凉干燥处备用。

表1 基础饲料组成及营养水平（干物质基础）Tab.1 Composition and nutrient levels of the basal diet（DM basis）

1.2 养殖管理

养殖试验在江西农业大学水产养殖基地中进行，养殖箱为88 cm×66 cm×64 cm 蓝色塑料桶，在养殖箱内放置一定数量的水葫芦，养殖用水为经过曝气的自来水。光周期为自然周期，每次喂食记录水温，喂食至大部分黄鳝停止摄食为止，并略带剩余，0.5 h 后观察并捞出剩料、风干计重。整个试验期间水温20.5～28.7 ℃，溶解氧不低于5 mg/L，pH 为6.5～7.4，氨氮浓度不高于2.0 mg/L 和亚硝酸浓度不高于0.10 mg/L。

1.3 样品采集和相关计算

养殖56 d 后停食24 h，对各养殖箱计数及称重，计算增重率、特定生长率（%/d）和饲料系数，相关计算公式如下：

式中：W1、W2分别代表试验黄鳝初均重和末均重（g）；t代表养殖天数（d）；F代表平均摄食量（g）。

从各箱中随机选取4 尾接近均重的黄鳝运回实验室解剖取样。准确称重、测量体长后断尾采血，采血完成后将黄鳝置于无菌冰盘上进行解剖，取肝脏组织浸泡于4%多聚甲醛溶液，用于制备HE 染色切片。血液于4 ℃环境静置24 h，取上清液于-80 ℃超低温冰箱保存。

1.4 组织HE切片分析

在光学显微镜（BM2000D江南永新光学仪器有限公司）下观察肝脏组织切片，并拍照，使用软件ScopeImage 9.0 对切片进行标注。

1.5 营养成分测定

饲料营养成分测定采用相同方法；水分含量测定参考GB/T 6435—2014；粗灰分含量测定参考GB/T 6438—2007；粗脂肪含量测定参考GB/T 6433—2006；粗蛋白质含量测定参考GB/T 6432—1994；饲料维生素A含量检测参照GB/T 17817—2010。

1.6 血清生化指标测定

严格按照南京建成生物工程研究试剂盒的说明书测定血清谷草转氨酶活性（GOT）、谷丙转氨酶活性（GPT）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（T-CHO）含量。

1.7 数据处理与分析

结果采用平均值±标准误（mean±SE）表示，用SPSS 25.0进行单因素方差分析（one-way ANOVA），若组间差异显著，再用Duncan’s氏多重比较检验，显著水平为P＜0.05。回归折线利用Excel 2019制作分析。

2 结果与分析

2.1 饲料维生素A水平对黄鳝生长性能的影响

由表2 可知，饲料维生素A 水平对黄鳝的末均重（FBW）、增重率（WGR）和特定生长率（SGR）有显著影响（P＜0.05），L3组黄鳝的FBW、WGR 和SGR 最高，显著高于L1组（P＜0.05），与其他组无显著差异（P＞0.05）。各组饲料系数（FCR）、存活率（SR）无显著差异（P＞0.05）。作折线回归分析饲料维生素A水平与WGR的关系（图1），黄鳝对饲料维生素A的适宜水平为3 482 IU/kg。

图1 饲料维生素A水平与黄鳝WGR之间的关系Fig.1 Relationship between dietary vitamin A levels and WGR of Monopterus albus

表2 饲料维生素A水平对黄鳝生长性能的影响Tab.2 Effects of dietary vitamin A levels on growth performance of Monopterus albus（n=4）

2.2 饲料维生素A对黄鳝形体参数和脏体指数的影响

由表3可知，饲料维生素A添加水平对幼鳝肝体指数、脾体指数和肥满度无显著影响（P＞0.05），脾体指数有先升高后降低的趋势。

表3 不同维生素A添加水平对黄鳝形态参数的影响Tab.3 Effects of different vitamin A levels on morphological parameters of Monopterus albus（n=8）

2.3 饲料维生素A对黄鳝血清生化指标的影响

饲料维生素A 添加水平对幼鳝血清生化指标的影响见表4。随饲料维生素A 添加水平的升高，血清GOT 和GPT 呈现先降低后升高的趋势，L7 组血清GOT 最高，L1 组次之，显著高于L2～L6 组（P＜0.05），L2～L6 组无显著差异（P＞0.05）。L7 组血清GPT 显著高于L1～L5 组（P＜0.05），L6 组次之，显著高于L2～L4组，且L1～L5组间无显著差异（P＞0.05）。血清总T-CHO 和TG含量随饲料维生素A水平升高呈现先上升后下降的趋势，L5组T-CHO 含量显著高于L1、L6和L7组（P＜0.05），与L2～L4组无显著差异（P＞0.05），L3组TG含量最高，L6组次之，L1、L2、L5和L7组最低。

表4 不同维生素A添加水平对黄鳝血清生化指标的影响Tab.4 Effects of different vitamin A levels on serum biochemical indexes of Monopterus albus（n=4）

2.4 饲料维生素A对黄鳝肝脏显微结构的影响

L1 组黄鳝肝细胞排列没有规律，肝细胞肿大，细胞核偏移至一侧，部分细胞核消失，部分肝细胞破裂。L2～L5 组黄鳝肝脏结构较为完整，肝小叶结构明显，细胞核明显且多数位于细胞中央。L6、L7 组黄鳝肝细胞出现空泡化，细胞无核或核偏移数量多。

图2 饲料维生素A添加水平对黄鳝肝脏显微结构的影响Fig.2 Effect of dietary vitamin A levels on liver microstructure of Monopterus albus

3 讨论与结论

生长性能（主要是WGR）是用于评估适宜维生素A 需求的常见评价指标，但在某些情况下，也会使用缺乏或过量摄入的临床症状、最大肝脏储备水平作为评价指标[31]。本试验中，喂食维生素A 水平为2 910 IU/kg 组黄鳝的WGR、SGR显著低于3 520 IU/kg组，表明饲料维生素A水平低于2 910 IU/kg时会影响小规格黄鳝的生长速度，以黄鳝WGR 作为评价指标，通过折线回归分析小规格黄鳝饲料维生素A 的适宜水平为3 482 IU/kg（图1）。这与青鱼幼鱼[32]、大口黑鲈（Micropterus salmoides）[33]和花鲈[5]等报道基本一致，饲料维生素A不足会导致鱼类生长减缓。

肝脏在维生素A的代谢、摄取、储存和释放中起着重要作用[35]。在鱼类中，膳食中缺乏维生素A已被证明会导致鱼体肝脏损伤和肝脏体积减小。Taveekijakarn[35]等观察到大马哈鱼（Oncorhynchus keta）在维生素A 缺乏的饲料中喂养22周后出现肝脏损伤，包括肝板分离和肝细胞萎缩和坏死。本试验中，L1、L6和L7组肝脏细胞较其他组肝细胞偏大，细胞核消失数量较多，L6和L7组肝细胞出现空泡化。饲喂缺乏维生素A 饲料的幼建鲤（Cyprinus carpiovarJian）的肝体指数显著降低[36]。在日本比目鱼中，Hernandez[29]等发现饲喂不同维生素A 水平鱼的肝体指数没有显著差异，但饲喂不添加维生素A 饲料的鱼肝体指数值较低。本试验结果表明，饲料维生素A 对黄鳝肝体指数、脾体指数和肥满度无显著影响。一般来说，血清GOT 和GPT 活性可反映肝脏受损程度，这两种酶通常在暴露于毒素、压力、疾病或营养不良的鱼类中作为评估之一[37]。Hernadez 等[29]等研究了饲料中维生素A 缺少或者过量对日本比目鱼血清GOT 和GPT 活性的影响，以其评价比目鱼肝脏的损伤程度，结果发现，对照组和添加25 000 IU/kg 维生素A 试验组比目鱼血清中GOT 和GPT 活性显著高于其他试验组，说明饲料中过少或过多的维生素A 都会对肝脏造成损伤。为进一步验证黄鳝肝脏组织是否受损，试验测定了黄鳝血清转氨酶活性，其中L1 和L7 组血清转氨酶活性显著高于L3～L5，说明在饲料维生素A 不足或过量，黄鳝肝脏可能受到一定程度损伤。这与吉富罗非鱼[15]和花鲈[5]的研究结果一致。

鱼类血清中T-CHO 和TG的含量一定程度上反映了机体脂质代谢情况，T-CHO 和TG都主要在肝脏中合成[38]。本试验中，黄鳝血清T-CHO 和TG 含量随饲料维生素A 增加呈先上升后下降的趋势。张璐[5]等研究发现，维生素A 缺乏组（245 IU/kg）花鲈血清T-CHO 和TG 含量显著低于正常组，且与肝脏脂肪含量的变化情况是一致，推测维生素A 缺乏时，花鲈营养不良且肝脏可能受到损伤；当饲料维生素A 含量达到15 273 IU/kg时，血清T-CHO和TG显著下降，过量的维生素A对花鲈肝脏造成了一定毒害作用。本试验得到了相似结果，饲料维生素A含量不足或者过量可能会影响黄鳝肝脏脂质代谢。

以WGR 作为评价指标，折线分析得出黄鳝对饲料维生素A 的适宜水平为3 482 IU/kg，综合生产性能、肝功能和肝脏显微结构考虑，黄鳝适宜维生素A 水平为3 230～5 020 IU/kg。饲料维生素A 不足（2 910 IU/kg）时，生长速度减缓。饲料维生素A 水平过高（7 030 IU/kg）时，不会显著降低生长速度，但对肝脏产生一定的负面影响。