光敏ROS 响应型雷帕霉素脂质体的制备及表征

高习清，卢光照，鲁 莹，邹 豪

（海军军医大学药学系药剂学教研室, 上海 200433）

近红外光响应的肿瘤光热治疗因具有组织穿透性强、生物安全性好等优点，已引起广泛关注。作为新兴的光敏剂，八丁氧基酞菁钯具有成本低、易合成、毒性低等优点，在肿瘤光动力治疗(PDT)领域表现出巨大潜力。由于高渗透强滞留效应(EPR)，脂质体作为药物载体可靶向集中于肿瘤组织，同时ROS 可氧化破坏脂质双层膜，促进包载药物在肿瘤组织的精准释放。本实验以雷帕霉素为模型药物，采用课题组合成的八丁氧基酞菁钯为光敏剂，制备近红外光触发的ROS 响应型雷帕霉素脂质体，并对其理化性质及体外释放特性进行考察。

1 材料与方法

1.1 仪器

R206D 旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)；730 nm/1 500 mW 激光器(长春市亮丽光电有限公司)；U3000 高效液相色谱仪(Thermo Fisher 公司)；JY92.IIDN 超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；马尔文激光粒度仪(英国Malvern公司)。

1.2 试剂

二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC，Avanti 公司)；1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（DLPC，Avanti公司）；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-mPEG2000，Lipoid 公司)；胆固醇、雷帕霉素（MCE 公司）、八丁氧基酞菁钯[PdPC(OBu)8，实验室自制]；磷酸盐缓冲液（PBS，HyClone 公司）。

1.3 脂质体的制备[1]

采用薄膜分散法制备脂质体。精密称取DSPC、DLPC、胆固醇、DSPE-mPEG2000、雷帕霉素、八丁氧基酞菁钯置于250 ml 圆底烧瓶中，加入适量氯仿溶解。65 ℃水浴，65 r/min 减压旋转蒸发形成均匀薄膜，取PBS 溶液4 ml 水化。吸出脂质体，用PBS 稀释至5 ml，200 W 探头超声5 min，即得近红外光触发ROS 响应型雷帕霉素脂质体。空白脂质体除不加雷帕霉素、八丁氧基酞菁钯外，制备方法相同。

1.4 脂质体处方筛选

以脂质体成膜及水化效果、药物包封率及载药量、包载药物光敏释放效率为指标，从DLPC、胆固醇、DSPE-mPEG2000处方量及PdPC(OBu)8投药量对光敏ROS 脂质体处方进行单因素考察。

1.5 粒径、PDI 及Zeta 电位

取少量脂质体溶液，用去离子水稀释，使用马尔文激光粒度仪测量脂质体粒径、PDI 及Zeta电位。

1.6 雷帕霉素含量测定[2]

1.6.1 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（84∶16）；流速1.0 ml/min；检测波长：278 nm；柱温：50 ℃；进样量：20 μl。

1.6.2 标准曲线绘制

精密称取雷帕霉素2.50 mg 置于10 ml 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到浓度为250 μg/ml 储备液。精密吸取储备液800、400、200、100、40、20、10、4 μl，分别于5 ml 容量瓶中用甲醇定容。制成浓度为40、20、10、5、2、1、0.5、0.2 μg/ml 的对照品溶液。HPLC 仪检测并记录峰面积A，绘制出峰面积A与对照品质量浓度C的标准曲线并进行线性回归分析。

1.6.3 专属性考察

吸取雷帕霉素脂质体溶液500 μl 加入5 ml 容量瓶中，甲醇定容至刻度。超声20 min 破乳后，以10 000 r/min 进行超速离心10 min。取适量上清液过0.45 μm 有机膜，制得供试品溶液。吸取空白脂质体按同法制备阴性对照品溶液。分别取对照品、阴性对照品、供试品按照“1.6.1”项下方法进样，记录HPLC 图。

1.6.4 精密度

选取低、中、高3 个浓度的对照品溶液，1 d 内重复进样考察日内精密度，连续3 d 每天测定一次，考察日间精密度。

1.6.5 提取回收率

吸取用于制备选定的低、中、高3 个浓度对照品溶液的储备液于不同的5 ml 容量瓶中，同一浓度共制备3 个样品。向每个容量瓶中加入100 μl空白脂质体溶液，再用甲醇定容至刻度。超声20 min 破乳后，进行超速离心，10 000 r/min，10 min。取适量上清液过0.45 μm 有机膜，进行HPLC 检测。

1.7 包封率及载药量

包封率与载药量是评价脂质体的重要指标。包封率是脂质体中包封药物量与脂质体中药物总量的百分比。载药量是脂质体中药物量与脂质体总量的百分比。

精密吸取脂质体500 μl 置于5 ml 容量瓶中，甲醇稀释至刻度。超声20 min 破乳后，再进行超速离心，10 000 r/min，10 min。取适量上清液过0.45 μm 有机膜，进行HPLC 检测，计算得出脂质体中药物总量。

精密吸取适量脂质体溶液，先进行低速离心[3]，3 000 r/min，15 min。取上层液体500 μl 置于5 ml容量瓶中用甲醇稀释至刻度。超声20 min 破乳后，再进行超速离心，10 000 r/min，10 min。取适量上清液过0.45 μm 有机膜，进行HPLC 检测，计算出脂质体中包封药物量。

1.8 体外释放实验[2]

采用反向透析法测定雷帕霉素脂质体光敏释放特性。以30 ml 20%乙醇为释放介质，加入50 ml离心管内；另吸取1 ml 释放介质并加入透析袋内，将透析袋两端扎紧后放入离心管中；取300 μl 雷帕霉素脂质体，用730 nm，1 W/cm2近红外光照射5 min 后，转移至释放介质；将离心管移至摇床内，设置摇床条件为37 ℃，180 r/min。分别在1、2、4、8、12 h 从透析袋内取样200 μl，用于样品测定和累积释放率的计算。取样后即补加新鲜释放介质200 μl，保持释放介质总量不变。以时间(t)为横坐标，以累积释放率(Q%)为纵坐标，绘制释放曲线。

2 结果

2.1 雷帕霉素的含量测定

2.1.1 标准曲线的绘制

回归方程为A= 0.624 0C-0.173 8 （r= 0.999 5）。雷帕霉素在0.2～40 μg/ml 浓度范围内线性关系良好。

2.1.2 专属性考察

按照“1.6.1”项下色谱条件测定，雷帕霉素出峰良好，保留时间为7.8 min。表明此方法专属性良好（图1）。

图1 雷帕霉素的专属性

2.1.3 精密度考察

由表1 可知，雷帕霉素在低、中、高3 个浓度都具有较好的准确度，日间精密度和日内精密度值均小于5%，表明该方法可用于雷帕霉素的含量测定。

表1 雷帕霉素 HPLC 分析的精密度( x±s ，n=3)

2.1.4 提取回收率

由表2 可知，雷帕霉素在低、中、高3 个浓度的回收率为97.64%～98.62%，符合95%～105%的范围，且RSD 值均小于1%，表明该提取方法稳定可靠。

表2 雷帕霉素 HPLC 分析的提取回收率( x±s ，n=3)

2.2 脂质体处方单因素考察

2.2.1 DLPC 用量

由表3 可知，包含不同摩尔量DLPC 的处方制得的脂质体，成膜及水化效果较好，粒径＜200 nm，PDI＜0.2，雷帕霉素包封率＞90%，载药量＞1%；脂质体体外释放试验，光照12 h 后，测得雷帕霉素药物累积释放率＞60%（图2A）。当DLPC 含量较低时（DSPC∶DLPC=69∶1），雷帕霉素释放速率明显低于其他处方。随着DLPC 含量的增加，雷帕霉素释放速率及12 h 内累积释放率并无明显增加。

表3 不同摩尔量DLPC 脂质体的表征

2.2.2 胆固醇用量

由表4 可知，PC（DSPC+DLPC）与胆固醇之比过大（70∶10）或过小（70∶40），脂质体都不能成膜。当PC 与 胆 固 醇 之 比 为70∶20、70∶25、70∶30 时，所得脂质体成膜及水化效果较好，粒径＜200 nm，PDI＜0.2，雷帕霉素包封率＞90%，载药量在1%左右。在进行脂质体体外释放实验中，测得12 h 后雷帕霉素药物累积释放率＞60%（图2B）。

2.2.3 DSPE-mPEG2000的用量

由表5 可知，当DSPE-PEG2000用量较小时，脂质体不能成膜。当PC 与DSPE-PEG2000之比为70∶5、70∶10、70∶15 时，所得脂质体成膜及水化效果较好，粒径＜200 nm，PDI＜0.2，雷帕霉素包封率＞90%，载药量＞1%。在进行的12 h 脂质体体外释放实验中，摩尔比70∶5 组测得雷帕霉素药物累积释放率＞60%，其余两组药物累积释放率在33%左右（图2C）。

2.2.4 PdPC(OBu)8的用量

由表6 可知，当PdPC(OBu)8用量较大（质量比1∶50），脂质体不能成膜。当PdPC(OBu)8与PC 质量之比为1∶100、1∶200、1∶300、1∶400，测 得 粒 径＜200 nm，PDI＜0.2，雷 帕 霉 素 包 封 率＞90%，载药量＞1%。在进行的12 h 脂质体体外释放实验中，质量比1∶100、1∶200 组释放效率高于其余两组，在60%左右（图2D）。

表4 不同摩尔量胆固醇脂质体的表征

图2 雷帕霉素光敏释放特性考察

表5 不同摩尔量DSPE-PEG2000 脂质体的表征

表6 不同用量PdPC(OBu)8 脂质体的表征

3 讨论

DLPC 是一种人工合成的不饱和磷脂，在制成的脂质体中，DLPC 将均匀分散在脂质双分子层膜上。当有ROS 存在时，DLPC 结构中的不饱和碳碳双键可被氧化，使脂质膜结构遭到破坏，促进包载药物的释放。光敏剂可在特定波长光照射下产生ROS，在肿瘤疾病的光动力治疗中得到广泛应用。但光敏剂自身潜在的光毒性和溶解性差是其突出缺陷。本文将光敏剂包载在脂质体中可以减少潜在的细胞毒性，同时可增加其溶解度。在研究脂质体中雷帕霉素释放的释放介质确定上，文献[2,4-5]中提供了多种选择。预实验显示，20%乙醇溶液作为释放介质时，不仅克服了脂溶性药物雷帕霉素在水中溶解性差的缺点，同时也使得在进行HPLC 检测时干扰峰较少。综上所述，本研究成功制备了光敏ROS 响应型雷帕霉素脂质体，表征结果较好。在短时间特定波长照射后，可实现脂溶性药物的快速释放。