枸杞果实中乙唑螨腈检测方法研究

牛 艳，陈 翔，杨 静，吴 燕，赵子丹，刘 霞

（农业农村部枸杞产品质量监督检验测试中心，宁夏农产品质量标准与检测技术研究所，宁夏回族自治区农产品质量标准研究与评价重点实验室，宁夏 银川 750002）

枸杞（Lycium barbarumL.）是我国传统名贵中药材，能够有效清除人体内的自由基，具有增强免疫力、防衰老、抗肿瘤、抗氧化、提高有益菌水平、促进神经系统损伤的功能性恢复等多方面的药理作用[1-5]。我国枸杞的种植面积逐年扩大，逐渐形成一定的产业规模。生产过程中为了防治枸杞螨虫等问题，通常会使用杀螨剂。乙唑螨腈是新型吡唑类杀螨剂[6-8]，通过代谢成羟基形式而活化产生活性，阻碍电子传递，从而破坏氧化磷酸化过程，具有触杀作用，对柑橘全爪螨[9-10]、始叶螨、蔬菜朱砂叶螨、花卉二斑叶螨[11]、荔枝叶螨[12]、西瓜二斑叶螨[13-14]、琯溪蜜柚红蜘蛛[15]等有较好的防治效果。在我国乙唑螨腈已在柑、橘、苹果等果蔬上获准登记使用，并已制定了相关的最大残留限量（MRL）[16]，但尚未制定检测方法标准。关于乙唑螨腈的检测分析方法有液相色谱法、液相色谱-串联质谱法，并已在少量作物上进行残留动态研究[17-21]，而在枸杞果实中乙唑螨腈检测方法的研究目前尚未见报道。

本研究建立了以乙腈为提取溶剂，经N-丙基乙二胺（PSA）及石墨化碳黑（GCB）净化，采用液相色谱-质谱/质谱（UPLC-MS/MS）法测定枸杞中乙唑螨腈的分析方法，操作简单，结果准确。检测枸杞中乙唑螨腈残留，旨在为我国制定乙唑螨腈在枸杞中的农药最大残留限量提供分析方法，对枸杞产业的发展也具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

枸杞，品种为宁杞7号，采自宁夏农林科学院园林场试验基地。取1 kg鲜果作为直接测试样品，另取2 kg鲜果制干（采后的新鲜枸杞，经2%的食用级碳酸钠或碳酸氢钠水溶液浸渍5～10 s脱蜡，沥干后晾晒制干），作为枸杞干果试验样品。

乙唑螨腈标准品（CAS号1253429-01-4，纯度99%），德国HPC公司；乙腈、甲醇（色谱纯），美国默克试剂公司；氯化钠（分析纯，140℃烘烤4 h），国药集团化学试剂有限公司；N-丙基乙二胺吸附剂（40～63μm），石墨化碳黑（120～400目），美国安捷伦公司；水为去离子水。

1.1.2 仪器与设备

Thermo TSQ Quantum型超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪，美国赛默飞公司；Heal Force Neofuge 18R型高速离心机，香港力康发展有限公司；MS3 digital型涡流混合器，德国IKA公司；PL202-L型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SMT-Y09型组织捣碎机，深圳斯玛特智能电器发展有限公司；THZ-82A水浴恒温振荡器，金坛荣华仪器制造有限公司；超纯水机、精密移液枪以及其他实验室常用仪器设备。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

将鲜、干枸杞样品于-18℃冷冻冰箱中保存。试验时将鲜、干枸杞样品取出，鲜样用高速组织捣碎机打浆，干样用高速万能粉碎机（可加少量的液氮）粉碎（30 g样品粉碎时间为30 s），分别置于样品瓶中，-18℃冷冻备用。

1.2.2 样品的提取与净化

分别称取枸杞鲜果10.00 g、干果5.00 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，在水浴恒温振荡器中振荡40 min，加入5.0 g氯化钠，盖上盖子，振摇约1 min，放入离心机，于4 000 r/min离心5 min，吸取2 mL上清液于15 mL离心管中（提前称好50 mg PSA和10 mg GCB）涡旋净化后过0.22μm滤膜，用液相色谱-质谱/质谱法测定。

1.2.3 液相色谱条件

色谱柱：Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm）；柱温：35℃；流速：0.3 mL/min；进样量：1μL；流动相梯度见表1。

表1 流动相洗脱条件Table 1 Fluid phase elution conditions

1.2.4 质谱条件的优化

取1 mL 10 mg/L的乙唑螨腈标准工作液，在正离子模式下进行母离子全扫描，得到乙唑螨腈母离子[M]+（m/z394.1）。对母离子施加不同的碰撞能量，对产生的子离子进行全扫描，得到相对丰度较高的乙唑螨腈子离子[M]+（m/z310.1）和[M]+（m/z254.0），质谱条件为离子源：电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子源；离子喷雾电压：3.5 kV；毛细管传输温度：300℃；碰撞压力：0.199 5 Pa；鞘气：30 arb；辅气：10 arb；检测方式：多反应监测模式（MRM）。具体质谱检测参数见表2。

表2 乙唑螨腈的多反应离子监测分析参数Table 2 Multi-reactive ion monitoring and analysis parameters of cyetpyrafen

1.2.5 数据处理

所有数据采用Thermo Xcalibur Quan Browser软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 标准工作曲线

将乙唑螨腈标准品分别用乙腈溶解并定容，配制成1 000 mg/L的标准储备溶液，再分别用乙腈稀释配制成10 mg/L的标准储备液，于-18℃冰箱中保存备用。为了消除基质效应的影响，使用枸杞空白样品提取液再分别逐级稀释为0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.0 mg/L系列标准溶液。在仪器条件下测定，浓度为0.1 mg/L乙唑螨腈标准溶液色谱图见图1，出峰时间在6.30 min。以标准溶液浓度和峰面积作标准曲线，得出乙唑螨腈线性回归方程、相关系数，结果见图2。在0.01～1.0 mg/L范围内，乙唑螨腈的进样质量浓度（x）与色谱峰面积（y）间线性关系良好，线性方程y=1×107x+115 848，R2=0.999 3，定量限（LOQ）=0.01 mg/kg。

图1 乙唑螨腈标准溶液（浓度为0.1 mg/L）LC-MS/MS的多反应监测色谱图Fig.1 Multi-reaction monitoring chromatogram of cyetpyrafen standard solution(0.1 mg/L)using LC-MS/MS

图2 乙唑螨腈标准曲线Fig.2 Standard curve of cyetpyrafen

2.2 提取溶剂的选择

提取溶剂应与残留分析的化合物有良好的溶解性和稳定性，适于样品制备和色谱分析，不仅要求目标物被充分提取，而且提取的杂质干扰越少越好。根据乙唑螨腈性质，常用的提取剂有乙腈、甲醇和乙醚。在提取溶剂研究中，对比了3种提取溶剂对枸杞鲜、干样品乙唑螨腈的提取效果，结果见图3。通过在不同溶剂中的提取率试验及色谱扫描峰面积与相对标准偏差值的比较结果可知：用甲醇或乙醚提取枸杞样品中的乙唑螨腈时，回收率均不能达到分析检测的要求；而采用乙腈提取时，乙唑螨腈的平均回收率均在87.8%～97.3%之间，相对标准偏差（RSD）在5.5%～12.0%之间，完全能满足分析检测要求。因此，确定溶解性和稳定性最好的乙腈作为枸杞鲜、干样品的提取溶剂。同时，试验还进行了不同提取次数对提取效果的影响研究，结果表明，提取1次与提取2次、3次结果差异不大。从提取效率角度考虑，提取1次完全可以达到较好的效果，最终确定使用乙腈为提取溶剂，提取1次。

图3 不同提取剂提取效果的研究Fig.3 Research on the extraction performance usingdifferent extractants

2.3 吸附剂的优化

针对目前常用的色谱前处理方法固相萃取（SPE）、QuEChERS法，通过测定乙唑螨腈添加回收率，对各个方法进行筛选。由图4可见，固相萃取与QuEChERS法效果差异不显著，从前处理效率考虑，固相萃取较QuEChERS法用时长，从成本考虑，固相萃取较QuEChERS法费用高，综合后最终确定最佳前处理方法为采用QuEChERS方法处理，用乙腈提取，PSA和GCB净化。

图4 不同前处理方法效果的对比Fig.4 Comparisons of the effects of different pretreatment methods

分别考察了不同质量的PSA对净化效果和回收率的影响。由图5可见，选用20、50、100 mg PSA，鲜果、干果2种基质中乙唑螨腈的回收率分别为66.2%～86.1%、80.1%～103.0%和63.1%～80.2%。最终选用50 mg PSA加10 mg GCB。鉴于2种基质中乙唑螨腈均满足农药残留检测的要求，因此未进一步研究基质效应的影响。

图5 不同质量PSA吸附剂对净化效果的影响Fig.5 Influence of different weights of PSA adsorbents onpurification effect

2.4 回收率和精密度

在枸杞空白样品中分别添加3个浓度水平（0.01、0.1、1.0 mg/kg）的乙唑螨腈标准溶液，每个浓度重复5次，按照上述方法对样品进行测定，结果见表3。枸杞鲜果、干果中乙唑螨腈添加回收率在80.4%～105.6%，RSD在5.5%～12.0%，符合农药残留被测组分为0.01～1.0 mg/kg时精密度为18%～22%的要求，该方法高效、快速，具有可行性。乙唑螨腈在枸杞鲜、干果空白及0.1 mg/L添加回收总离子流图见图6。

图6 乙唑螨腈在枸杞鲜、干果上空白及添加色谱图Fig.6 Chromatograms of fresh and dried Goji berries with and without the addition of cyetpyrafen

表3 枸杞（鲜果、干果）中乙唑螨腈添加回收率、精密度（n=5）Table 3 The recovery rate and accuracy of the addition of cyetpyrafen in Goji berries(fresh fruit,dried fruit)(n=5)

3 结论

本文采用QuEChERS方法处理，乙腈提取，PSA和GCB净化，建立了枸杞鲜果、干果中乙唑螨腈残留检测方法，并对方法的回收率、精密度进行了探讨。结果表明，使用该检测方法乙唑螨腈农药在枸杞鲜果、干果中平均回收率为80.4%～105.6%，相对标准偏差为5.5%～12.0%，定量限为0.01 mg/kg，方法的精密度和准确性较好，符合农残分析的要求[22-23]，具有可行性。