米槁根际细菌对果实药用活性成分的影响及其PICRUST功能预测分析

田 秀，童炳丽，谢元贵，3，*，廖小锋，吴婷婷，刘济明

(1.贵州大学 林学院，贵州，贵阳 550025； 2.贵州师范大学 生命科学学院，贵州 贵阳550025； 3.贵州科学院，贵州 贵阳 550001； 4.贵州省山地资源研究所，贵州 贵阳550001)

米槁(H.W.Li)为樟科常绿乔木，主要分布在南北盘江与红水河谷区域，贵州、广西、云南等省交界处，是我国西南地区的特有种，其成熟干燥的果实常用作民族药材、香料和调味品。作为药用植物，米槁果实提取的化合物在抗炎、抗心律失常、抗肿瘤等方面有重要作用，以米槁果实提取化合物为主要成分的心脑宁胶囊、心胃止痛胶囊等在治疗肠胃和脑血管疾病中具有良好的效果。米槁药用市场大，但常处于野生状态，加上民间的日益采伐，其野外储藏量急剧减少；加上其天然分布区狭窄，结果有大小年之分、种子发芽率低等问题，米槁已被列入近危植物名单中。

微生物是土壤生态系统中的重要组成部分，以植物根系分泌物为能量来源，能感知根系分泌的信号并释放，提高植物耐受性、抗逆性，促进植物的生长发育。细菌占土壤微生物中的绝大部分，参与植物的生长、繁殖和代谢，有益的细菌群落有利于植物增产。由于技术手段的局限，以往对土壤根际细菌的研究主要集中于结构、多样性等方面，而对功能方面的研究少有报道。基于高通量测序的PICRUST功能预测分析具有高效率、成本低、结果可靠等特点，能实现对细菌生态功能的预测，有利于进一步揭示细菌在土壤生态系统中的作用，已应用于多个领域。1，8-桉叶素、香桧烯、α-香油醇、柠檬烯是米槁果实中主要的药用活性成分，研究米槁根际细菌群落组成、功能及其与活性成分间的潜在关联性，有利于阐明米槁生长发育的内在机制，提高米槁药用成分产量。本研究通过采集黔、滇、桂3省交界处的米槁根际土壤与果实，分析不同采样点米槁根际细菌群落组成与功能、土壤理化特性与果实药用活性成分的含量变化，阐明米槁根际土壤-细菌-果实药用活性成分间的影响与相互作用，为提高米槁果实活性成分产量提供依据。

1 材料与方法

1.1 米槁根际土壤与果实采集

选取贵州罗甸(LD)、望谟(WM)、册亨(CH)、贞丰(ZF)、荔波(LB)，广西天峨(TE)、乐业(LY)，以及云南富宁(FN)、那坡(NP)共9个采样点。于2018年10月，在各采样点随机选择5棵长势相同(胸径为32～38 cm)的健康野生米槁，利用抖落法在米槁四周根际采集土壤样品。土壤样品采集时，先去除土壤表层腐殖质后，挖取距根系2 mm内的土壤为根际土壤。将5棵树采集的土壤等量混合后装入灭菌袋，保存于冰盒迅速带回实验室。将样品分为2份，一份自然晾干过筛用于土壤理化性质测定，一份提取土壤细菌基因组DNA后用于高通量测序。果实与土样采集同时进行、保持一致，用于测定其中的药用活性成分含量。在果实选取上，选择颜色为黑绿色或棕黑色的成熟果实作为样品。

1.2 根际土壤理化性质测定

测定自然风干过筛后的土壤pH值和有机质、全氮、碱解氮、全磷、速效磷、全钾、速效钾含量。其中，采用点位法测定pH值，采用重铬酸钾容量法测定有机质含量，采用碱解扩散法测定全氮、碱解氮含量，采用钼锑抗比色法测定全磷、速效磷含量，采用火焰光度法测定全钾、速效钾含量，具体测定方法参照《土壤农化分析》。

1.3 果实药用活性成分含量测定

利用气相色谱(GC)法测定1，8-桉叶素、香桧烯、柠檬烯和α-松油醇含量。标准品(纯度为98%)购买于成都德斯特生物技术有限公司。其中，气相色谱条件为HP-5毛细管柱(30 m×320 mm，0.25 μm)，采用程序升温，初始柱温为50 ℃，保持3 min；后升温至85 ℃(升温速率为5 min·℃，下同)，保持2 min；升温至90 ℃，保持2 min，后升温至160 ℃和220 ℃，保持时间为0 min；进样口温度为200 ℃，接口温度为235 ℃，载气为高纯氮气，进样量为1 μL，流速为1 mL·min，分流比为10：1。

1.4 根际土壤细菌高通量测序

按DNA提取试剂盒FastDNASPINKit for Soil说明书提取、纯化米槁根际土壤细菌DNA，用引物338F(ACTCCTAGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)进行PCR扩增(V4-V5区)，扩增体系(20 μL)：模板DNA 10 ng，5× Buffer 4 μL，2.5 mmol·LdNTPs 2 μL，Fastpfu多聚酶0.4 μL，BSA 0.2 μL，补ddHO至20 μL。扩增条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 3 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 42 s，29个循环；72 ℃ 10 min。

根据PCR产物浓度进行等量混样后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用上海美吉生物医药科技有限公司提供的胶回收试剂盒回收PCR产物，进行16S rDNA高通量测序。

1.5 数据分析

利用Excel 2019软件对土壤理化性质、药用活性成分含量等进行数据统计，用SPSS 19.0软件的单因素方差分析和多重比较对其进行差异性检验；用Mothur1.30.2软件计算各样点土壤细菌的辛普森指数、香农指数与覆盖度；用PICRUST1.1.0进行16S序列的GOC、KEGG的功能预测；用Bray-Curtis距离算法计算各样本间距离，然后利用FastUniFrac分析得到样本间距离矩阵；用R 语言3.3.1 vegan包进行冗余分析和作图。

2 结果与分析

2.1 根际土壤理化性质

如表1所示，几个采样地的pH值变化范围为4.19～6.82，为酸性土壤，各样点差异显著(<0.05)；同样地，各样点有机质含量明显不同，罗甸的有机质含量显著高于其他样点。全效养分与速效养分在各样点的变化趋势也存在差异。其中，全氮在各样点间无显著差异(>0.05)，荔波的碱解氮含量显著高于其他样点；全磷含量在罗甸最高，各样点间差异显著，速效磷在乐业、罗甸、望谟、天峨、富宁、荔波样点则无显著差异；乐业的全钾含量略高于荔波，且明显高于其他样点，有效钾则表现为在望谟最高，与其他样点间差异显著。

表1 米槁根际土壤理化特性

2.2 果实药用活性成分含量分析

对米槁果实中药用活性成分进行测定，结果见图1，乐业采摘的果实中，活性成分1，8-桉叶素、α-松油醇、柠檬烯等成分含量最高，与其他采样点间差异显著(<0.05)。其中，望谟与天蛾、册亨与贞丰在1，8-桉叶素含量上无显著差异，罗甸、册亨采摘的果实中α-松油醇含量无显著差异；与天峨采摘的果实相比，望谟采摘的果实中香桧烯含量略高，尽管两者间香桧烯含量无显著差异，但皆明显高于其他采样点(<0.05)。在所有采样点中，富宁采摘的果实中1，8-桉叶素、α-松油醇、柠檬烯、香桧烯含量均最低。

LD，罗甸；WM，望谟；CH，册亨；ZF，贞丰；TE，天峨；LY，乐业；FN，富宁；NP，那坡；LB，荔波。柱上无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。LD， Luodian； WM， Wangmo； CH， Ceheng； ZF， Zhenfeng； TE， Tian’e； LY， Leye； FN， Funing； NP， Napo； LB， Libo. Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.图1 米槁果实药用活性成分的含量Fig.1 Content of medicinal active ingredients in C. migao fruits

2.3 根际土壤细菌Alpha多样性分析

利用高通量测序方法对9个采样点的根际土壤样品细菌进行测序，共得到615 066条有效序列，2 112个OTUs，平均长度为434.4 bp。各样点的覆盖率均大于99%，测序结果能够真实地代表米槁根际土壤细菌群落的情况。望谟的香农指数最大，其次是册亨，荔波最小，辛普森指数有相反的变化趋势(表2)。表明望谟根际土壤细菌多样性较丰富，荔波根际土壤细菌多样性较低。

表2 米槁根际土壤的细菌Alpha多样性

2.4 细菌群落结构组成

9个土壤样品细菌菌群鉴定的OTUs归属于29个门，对丰度小于0.01%的菌门聚类为others，米槁根际土壤细菌菌群在柱形图上共有11个门(图2)，分别是变形菌门(Proteobacteria，34.81%)、酸杆菌门(Acidobacteria，21.85%)、放线菌门(Actinobacteria，16.71%)、绿弯菌门(Chloroflexi，10.61%)、疣微菌门(Verrucomicrobia，3.48%)、浮霉菌门(Planctomycetes，2.34%)、硝化螺菌门(Nitrospirae，2.86%)、厚壁菌门(Firmicutes，2.38%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes，1.68%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，1.64%)，及一未识别类(unclassified_k_norank，0.59%)。综合比较，变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、绿弯菌门是米槁根际土壤的优势菌门，相对丰度皆在10%以上。米槁根际土壤细菌菌群在不同采样点均有分布，但各菌门在不同采样点的丰度有所不同，变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、绿弯菌门丰度在不同采样点的变化范围分别为27.57%～43.78%、7.08%～30.05%、11.08%～23.66%、5.01%～12.76%。其中，变形菌门在荔波丰度(43.78%)最高，望谟丰度(27.57%)最低；酸杆菌门在天峨丰度(30.05%)最高；册亨的放线菌门丰度(23.66%)较高，在荔波丰度(11.08%)较低；绿弯菌门在望谟丰度(12.76%)最高，在荔波丰度(5.01%)最低。

图2 门水平上的物种相对丰度分布图Fig.2 Distribution of relative abundance of species on phylum level

9个土壤样品细菌类群分布在63个纲，其中，21个纲为几个采样点共有(图3)。物种丰富度前4的菌群中，α-变形杆菌纲(Alphaproteobacteria)、酸杆菌纲(Acidobacteria)为各采样点共有的优势菌纲。除此之外，册亨、罗甸、那坡、贞丰的优势菌纲为放线菌纲(Actinobacteria)、纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)，天峨、望谟的优势菌纲为丙型变形菌纲(Gammaproteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)，乐业的优势菌纲为α-变形菌纲(Deltaproteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)，荔波的优势菌纲为丙型变形菌纲(Gammaproteobacteria)、硝化螺菌纲(Nitrospia)。综合比较，α-变形杆菌纲(25.47%)、酸杆菌纲(21.84%)、放线菌纲(16.73%)、纤线杆菌纲(4.94%)为米槁根际土壤中的优势菌纲，相对丰度之和为68.98%，占整个菌纲的一半以上。

图3 纲水平上的物种相对丰度分布Fig.3 Distribution of relative abundance of species on class level

9个土壤样品细菌类群分布在387属(图4)。将相对丰度位于前30的细菌分别按照样品和分类进行聚类后绘制热图，可分为3个大支，主要集中在疣微菌门、酸杆菌门、变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、绿湾菌、浮霉菌门、硝化螺菌门、芽单胞菌门共9个门中。其中，最为优势的OUT单元为变形菌门。各采样点间优势菌属存在一定差异，册亨的酸杆菌纲一未定属(，8.08%)、酸杆菌科一未定属(Acidobacteriaceae_surbgroup_1，7.59%)丰度较高，富宁(FN)的酸杆菌纲一未定属(，10.25%)、黄色杆菌科一未定属(，5.72%)丰度较高，荔波的硝化螺菌属(，12.77%)、黄色杆菌科一未定属(，9.02%)丰度较高，罗甸丰度较高的属为酸杆菌纲一未定属(，9.34%)、DA111一未定属(DA111，7.14%)，乐业的酸杆菌纲一未定属(，5.57%)、变异杆菌(，5.49%)丰度较高，那坡的酸杆菌科一未定属(Acidobacteriaceae_surbgroup_1，7.22%)、热酸菌属(，8.70%)丰度较高，天峨的酸杆菌纲一未定属(，8.63%)、酸杆菌科一未定属(Acidobacteriaceae_surbgroup_1，8.46%)丰度较高，望谟的酸杆菌纲一未定属(，15.39%)、变异杆菌(，3.45%)丰度较高，贞丰丰度较高的为酸杆菌科一未定属(Acidobacteriaceae_surbgroup_1，8.33%)、热酸菌属(，11.86%)。综合比较，册亨与天峨、那坡与贞丰、富宁与乐业优势菌属有更高的相似性。

图4 属水平上的物种分布热图Fig.4 Species distribution heatmap on genus level

2.5 细菌群落与土壤理化特性的相关性

在属水平上，对米槁根际土壤中丰度前10的细菌群落与土壤理化特性间作冗余分析和相关性热图，结果见图5。RDA1和RDA2可分别解释59.41%、15.48%的变异率，累计解释率为74.89%，能较好地反映根系土壤细菌群落与土壤理化特性间的相互关系。其中，黄杆菌科一未定属与全氮呈极显著(<0.01)正相关，与碱解氮呈显著(<0.05)正相关；硝化螺菌属与全氮、碱解氮呈显著正相关；酸杆菌门中一未定属与全氮呈极显著负相关，与碱解氮呈显著负相关；除酸杆菌门中一未定属、硝化螺菌属外，pH值与其他菌属表现为显著负相关或极显著负相关；速效磷与慢生根瘤菌属()呈极显著负相关，与为显著负相关；有机质与暂定种呈显著负相关。综合比较，pH值、全氮、碱解氮对细菌群落多样性的影响较大。

TN为全氮，AN为碱解氮；TK为全钾，AK为有效钾；TP为全磷，AP为速效磷；OM为有机质。TN means total nitrogen， AN means alkaline hydrolysis nitrogen； TK means total potassium， AK means available potassium； TP means total phosphorus， AP means available phosphorus； OM means organic matter.图5 根际土壤特性与属水平上细菌的RDA分析和heatmap图Fig.5 RDA analysis and correlation heatmap between rhizosphere soil characteristics and bacteria on genus level

2.6 细菌群落与果实药用活性成分的相关性

RDA分析中，箭头越长，夹角越小，相关性越大。在属水平上，对米槁根际土壤中丰度前10的细菌群落与果实药用活性成分作冗余分析和相关性热图，结果见图6。各活性成分含量与、DA111、、酸杆菌门中一未定属、酸杆菌纲一未定属、暂定属等呈正相关，与、、黄杆菌纲一未定属、DA101呈负相关。其中，柠檬烯、香桧烯含量受DA101影响较大，相关系数分别为-0.500、-0.482；α-松油醇受硝化螺菌属影响较大，相关系数为-0.456；1，8-桉叶素受黄杆菌纲一未定属影响较大，相关系数为-0.413，各菌属对活性成分的含量具有一定的影响。

图6 药用活性成分与属水平上细菌的RDA分析和热图Fig.6 RDA analysis and correlation heatmap between medicinal active ingredients and bacteria on genus level

2.7 功能预测分析

利用PICRUST软件对9个采样点根际土壤进行菌群功能预测，比较几个采样点代谢功能通路的差异。KEGG pathway丰度统计分析表明，除未分类信息(unclassified)外，几个采样点共获得6种一级生物代谢功能通路功能基因(图7)，包括细胞过程(cellular processes)、环境信息处理(environmental information processing)、遗传信息处理(genetic information processing)、人类疾病(human diseases)、代谢(metabolism)、有机系统(organismal systems)。主要以代谢、遗传信息处理、未分类信息、环境信息处理为主，相对丰度皆为10%以上，且在各采样点无明显差异。

图7 基于KEGG pathway的功能基因相对丰度分布图Fig.7 Relative abundance distribution of functional genes based on KEGG pathway

利用GOC数据库进行对比，各采样点共包括25个功能基因群(图8)，占优势的主要有信号传导机制(signal transduction mechanisms)、一般功能预测(general function prediction only)、细胞壁/膜/包膜的生物发生(cell wall/membrane/envelope biogenesis)、能量生产与转换(energy production and conversion)、未知功能(function unknown)、氨基酸的运输和代谢(amino acid transport and metabolism)、转录(transcription)和碳水化合物的运输与代谢(carbohydrate transport and metabolism)等，可归纳为细胞的生物发生、能量与物质的运输代谢两方面。

J，翻译、核糖体结构和生物发生；Z，细胞骨架；N，细胞运动；L，复制、修复和重组；F，核苷酸的运输和代谢；G，碳水化合物运输与代谢；K，转录；D，细胞周期控制、细胞分裂、染色体分配；E，氨基酸的转运和代谢；S，功能未知；C，能量生产和转化；B，染色质结构和动力学；A，RNA加工和修饰；M，细胞壁/膜/包膜生物发生；W，细胞外结构；Q，次生代谢物的生物合成、运输和分解代谢；U，细胞内运输、分泌和囊泡运输；V，防御机制；O，翻译后修饰、蛋白质周转、调控；H，辅酶运输和代谢；P，无机离子转运与代谢；Y，核结构；I，脂质运输与代谢；R，一般功能预测；T，信号传导机制。下同。J， Translation， ribosome structure and biogenesis； Z， Cytoskeleton； N， cell motility； L， Replication， repair and recombination； F， Nucleotide transport and metabolism； G， Carbohydrate transport and metabolism； K， Transcription ； D， Cell cycle control， cell division， chromosome partitioning； E， Amino acid transport and metabolism； S， Function unknown； C， Energy production and conversion； B， Chromatin structure and dynamics； A， RNA processing and modification； M ， Cell wall/membrane/envelope biogenesis； W， Extracellular structures； Q， Secondary metabolites biosynthesis， transport， and catabolism； U， Intracellular transport， secretion， and vesicular trafficking； V， Defense mechanisms； O， Posttranslational modification， protein turnover， chaperones； H， Coenzyme transport and metabolism； P， Inorganic ion transport and metabolism； Y， Nuclear structure； I， Lipid transport and metabolism； R， General functional prediction only； T， Signal transduction mechanisms. The same as below.图8 基于GOC的功能基因相对丰度分布图Fig.8 Relative abundance distribution of functional genes based on GOC

基于以上结果与果实活性成分含量作冗余分析，结果见图9。RDA1和RDA2的累积解释率为84.08%，能较好地反映细菌功能与活性成分间的关系。柠檬烯、香桧烯、1，8-桉叶素、α-松油醇等与核苷酸转运和代谢(nucleotide transport and metabolism)、转录(transcription)、氨基酸转运和代谢(amino acid transport and metabolism)皆分布在第4象限，说明活性成分含量的积累主要受核苷酸、氨基酸的转运与运输、转录的影响，并与碳水化合物的转运与代谢(carbohydrate transport and metabolism)、防御机制(defense mechanisms)等呈正相关，与其他细菌功能呈一定负相关。

图9 根际土壤细菌的功能与果实活性成分积累的RDA分析Fig.9 RDA analysis of soil bacteria function in the rhizosphere and accumulation of active ingredients in the fruit

3 讨论

高通量测序是目前研究微生物多样性最多的的方法之一，广泛用于农、林、畜牧业中。香农指数和辛普森指数是反映微生物多样性的常用指标，香农指数的值越大，辛普森指数的值越小，微生物多样性越丰富。本研究中，天峨的OTU最多，望谟、乐业等地的香农指数较大，有较丰富的细菌多样性，4种活性成分含量明显高于其他产地。丰富的细菌多样性有利于促进米槁的生长，提高米槁果实药用活性成分含量。

细菌是土壤中数量最多的微生物群，能利用多种不同来源的碳作为能量，将复杂的有机化合物转化成简单化合物的同时为其他微生物提供基质，是土壤生态系统中养分的重要来源和库。在门水平上，米槁根际土壤的优势细菌门为变形菌门、酸杆菌门、放线菌门和绿弯菌门，均是土壤中常见的优势菌门。王甜甜等在不同生育期抗虫棉根际细菌群落研究中得出了相同的结果。米槁是道地性药材，根际细菌群落较复杂。在属的水平上，各采样点根际土壤细菌的优势属存在差异。活性成分较高的3个样点中，除酸杆菌纲一未定属(norank_c_Acidobacteria)外，为乐业、望谟的另一优势属。另外，在天峨的相对丰度为7.62%，仅低于酸杆菌科一未定属(Acidobacteriaceae_surbgroup_1，8.46%)。根际土壤特性与细菌间的关联性分析表明，黄杆菌科一未定属(norank_f_Xanthobacteraceae)、硝化螺菌属与各土壤特性呈正相关，与全氮、碱解氮含量呈显著正相关或极显著正相关，是土壤中常见的促生菌属；全氮、碱解氮与酸杆菌纲一未定属呈显著负相关和极显著负相关，pH值与、DA111、热酸杆菌属、慢生根瘤菌属、变异菌属等呈显著或极显著负相关，说明酸性土壤更有利于米槁根际细菌的生存，这与吕东英等对多枝怪柳的研究结果基本一致，与李明等对土壤盐碱地的研究结果相反。米槁是典型的阳生植物，高含量的磷有利于增加米槁对光的适应程度。本研究中，各产地米槁根际土壤的有效磷含量均较高，与各菌属呈负相关或显著负相关，反而抑制了各菌属的生存。同时，有机质、速效钾含量与各菌属呈不同程度的负相关。土壤理化因子是决定米槁根际土壤细菌群落结构与多样性的关键因子。

已有的研究中，氮输入通过固氮、硝化等对细菌的代谢潜力产生一定程度的影响。同时，根际微生物的代谢过程是保证土壤健康、植物产量的重要前提。基于高通量测序的PICRUST功能预测具有速度快、效率高等特点，已广泛用于各领域。孙峰等对丹江口库区滨带不同植被土壤细菌多样性的研究中发现，随植被类型的不同，土壤细菌间代谢能力也不同。米槁根际细菌与活性成分积累的关联性分析表明，4种活性成分与慢生根瘤菌属、DA101、硝化螺菌属呈负相关，与、DA111等呈正相关但不显著。基于此，对米槁根际细菌进行功能预测，探究细菌功能基因对活性成分积累的影响。结果表明，各活性成分与25个功能群呈不同程度的相关性，α-松油醇对各功能基因的响应最大，其次是1，8-桉叶素。说明细菌多样性主要通过不同功能基因对活性成分的积累造成不同的影响。

4 结论

米槁根际土壤细菌隶属于29门63纲387属，多样性丰富。各样点在门、纲水平上的优势菌一致，但在属水平上存在差异，主要以酸杆菌纲一未定属、酸杆菌科一未定属、黄杆菌科一未定属、热酸菌属、、硝化螺菌属等为主。其中，酸杆菌纲一未定属、在乐业、天峨、望谟均有较高的相对丰度，与4种药用活性成分的积累呈正相关。比较各采样点，乐业根际土壤肥力最好，活性成分产量最多。

米槁根际土壤细菌一级功能通路有6种，二级功能通路为25种，促进果实活性成分积累的主要为氨基酸、核苷酸与碳水化合物等能量物质的转运与代谢。土壤根际细菌多样性受pH值、氮含量的显著影响，而氮又广泛参与细胞的生物发生过程，是能量与物质的重要组成部分，且4种药用活性成分与25个细菌功能群呈不同程度的相关性。推测土壤因子可通过影响根际细菌多样性，改变土壤细菌功能，从而在一定程度上影响米槁果实活性成分的含量。