滇蛙两个种群遗传损伤及黑色素细胞免疫的水环境适应性*

王延辉， 何豪， 戴金洪， 敬凯

(云南师范大学 生命科学学院，生物能源持续开发利用教育部工程研究中心，云南省生物质能与环境生物技术重点实验室，云南 昆明 650500)

人类活动所致栖息地破坏和水环境变化是两栖动物种群数量降低甚至物种灭绝的主要因素之一[1].工农业生产及人类生活产生大量的水体污染物，其种类复杂，既有农业和畜牧业带来的农药或化肥残留以及生活污水，也有现代工业产生的新型污染物.两栖动物对这些物质极为敏感，其半致死浓度(LC50)通常较低，而水体中残留污染物的浓度却往往超过其数倍[2]，因而水环境对两栖动物的生存和繁殖具有重要影响.

细胞微核率通常作为生物遗传毒性的一个指示性变量，可反映环境污染物对生物的综合性危害[3].两栖动物对陆地生活适应不完善，皮肤薄且通透性高，皮肤的高通透性致使水环境中污染物容易穿透皮肤，进入血液，造成细胞DNA损伤，形成微核.如苯胺[4]和阿维菌素[5]均可导致两栖类微核的出现，并与其DNA损伤率表现出线性关系.水体污染物对蝌蚪的微核率还具有时间累积效应[6]，许多研究都表明无尾两栖动物微核率与水体环境因子具有直接联系.

黑色素巨噬细胞中心(melano-macrophage centers MMCs)是水生动物脾脏、肾脏和肝脏等的黑色素细胞、淋巴细胞以及抗体生成细胞等组成的复合体[7].蛙类MMCs在肝组织内呈现出不规则的黑色团块[8]，在脾脏中也有大量分布[9].MMCs是蛙类对内源和外源有害物质做出的反应，与动物的免疫应答过程密切相关.具有参与免疫、清除内源和外源异物、抗自由基或有毒物质、螯合重金属、抗病毒和抗菌等作用[10-11].其数量和大小反映了蛙类对不同水环境的免疫响应，也是动物对水环境适应的重要表现.

滇蛙(Nidiranapleuraden)是云贵高原常见的蛙类，隶属于无尾目(Anura)，叉舌蛙科(Dicroglossidae)，琴蛙属(Nidirana).滇蛙栖息地与人类活动区域高度重叠，为主要栖息于农田、沟渠和库塘等静水水域，偏水生的蛙类.目前对滇蛙的形态结构[12]、皮肤分泌物[13]、栖息地环境[14]和微核率[15]等都有一定认识，但对人类活动强度不同栖息地中的滇蛙的生存状况以及蛙类的遗传和生理响应仍缺乏相应了解.人类活动所致的栖息地水环境变化怎样影响滇蛙的遗传结构以及滇蛙如何在免疫上响应水环境变化的研究有助于揭示蛙类对不断变化的水环境的适应性.

为了解水环境对两栖动物的遗传毒理效应以及蛙类免疫的水环境适应性，选择云南省陆良县小百户镇和三岔河镇人类活动强度不同的两个栖息地对滇蛙血细胞微核率、肝脏和脾脏的黑色素巨噬细胞中心进行了研究.通过测定两个种群栖息地水环境，分析血细胞微核率以及肝脏和脾脏MMCs的数量及面积差异，了解滇蛙受到的遗传毒性压力和对不同水质环境的免疫响应，从而揭示滇蛙在人类活动强度不同的栖息地如何维持其种群的生存.

1 材料与方法

1.1 研究地点

云南省陆良县属北亚热带高原气候，年均气温14.8 ℃，降雨量850～1 250 mm，年均降雨量941.9 mm，年均蒸发量2 244.3 mm，无霜期246 d.陆良县是云南省重要的农业大县，人类生产和生活对当地水环境影响严重.坝区部分河流，如老盘江、护城河及阎芳河等水质均在Ⅳ-Ⅴ类之间[16].两个滇蛙种群所在的小百户镇和三岔河镇直线距离约20.1 km，小百户镇为山区半山区丘陵地区，人口密度为112人/km2，稻田及旱地为滇蛙的繁殖栖息地.三岔河镇大部分属于坝区，人口密度为1 223人/km2，是陆良县人口最多且人类活动强度最大的乡镇，坝区的沟渠和水田等是滇蛙主要的栖息地.前期调查发现小百户镇栖息地内有9种蛙类，而三岔河镇仅滇蛙1种蛙类.

1.2 样本采集

2021年5月至11月于云南省陆良县小百户镇及三岔河镇采集滇蛙成体及蝌蚪.采集地涵盖小百户镇的农田、河流、水库周边和永久性水塘，三岔河镇则为靠近村庄的荷塘及其沟渠.样本采集在夜间进行，使用强光手电寻找并捕获滇蛙成体，D型抄网捕捉滇蛙蝌蚪，获得滇蛙成体样本42只.使用水质分析仪测量采集地水体的pH值、水体溶氧量(OD)、水温(T)和电导率(σ).使用两步路户外助手(v7.0.0.0)记录采集地位置和海拔(A).

1.3 血液涂片及肝脾切片

于成体滇蛙心脏处取血，蝌蚪断尾后取血1.5 mL放于离心管中，按照血清∶血液=9∶1的比例混合，制作细胞悬浮液，800 r/min的速度离心5 min，采用Gimsa染色法[17]制作微核试验血液涂片.取蛙肝脏和脾脏在Bouins 固定液中固定，采用石蜡切片及HE染色法[18]制作肝脏和脾脏切片.

1.4 数据采集

在Olympus光学显微镜下观察血细胞涂片及肝脏切片并拍摄照片.观察记录血细胞中出现的微核情况，计数滇蛙血细胞涂片上单位面积的血细胞总数以及具有微核的血细胞数目以分析不同水环境中滇蛙血细胞的DNA损伤情况.每个个体制作两张涂片，使用细胞计数器对每张涂片计数血细胞2 000个左右，微核率以千分率(‰)表示.

为分析不同滇蛙种群的免疫反应，观察肝脏和脾脏切片，记录滇蛙肝脏和脾脏的结构特征.使用Phmias软件，在肝脏及脾脏切片上随机选取1 mm2面积，统计黑色素巨噬细胞中心(MMCs)的数量，以每个细胞边界为准，测定每个MMCs的面积，取每张切片的平均值为MMCs面积.

选择能够清晰观测到细胞结构的血涂片计数血细胞微核率，对组织结构清晰而完整的切片进行肝脏和脾脏的MMCs统计.由于制片和切片原因导致的无法清晰识别或识别困难的样本不纳入分析，因而微核率和MMCs分析样本数有差异.

1.5 数据分析

2 结果

2.1 栖息地环境

两个种群滇蛙的栖息地具有相似的气候环境，水体的水温、溶氧量以及水体可见度差异均不显著.但水体的电导率(P=0.033)及栖息地海拔(P=0.002)差异显著(表1)，三岔河镇海拔显著低于小百户镇，而水体电导率却显著高于小百户镇.

表1 滇蛙两个种群栖息地的海拔和水环境因子比较

2.2 血细胞微核率

血涂片的结果显示，两个种群滇蛙的血液中均有不同数量血细胞出现微核.三岔河种群滇蛙无论是成体还是蝌蚪，其血细胞的微核率均极显著大于小百户种群(表2)，说明三岔河滇蛙种群DNA受到的损伤要大于小百户种群.

表2 滇蛙两个种群成体和幼体血细胞微核率比较

2.3 肝脏和脾脏黑色素巨噬细胞中心

肝脏和脾脏的切片显示，滇蛙正常肝脏(图1a)和脾脏(图1c)组织中均有不同数量的MMCs.两个种群中，三岔河种群滇蛙部分个体(约1/3)肝组织内出现空泡化(图1b).空泡区肝组织内，肝细胞数量减少，边界模糊，组织内出现较大空隙，显示肝组织受到损伤.

MMCs:黑色素巨噬细胞中心;LC：肝细胞; KC:肝巨噬细胞;V：空泡; WP:白髓;RP：红髓;CA:被膜.

对滇蛙两个种群肝脏和脾脏的MMCs数量和面积的分析显示(表3)，三岔河种群滇蛙的肝脏MMCs数量要极显著多于小百户种群，但MMCs面积并无显著差异.同样，三岔河种群的脾脏MMCs数量也显著多于小百户种群，面积无显著差异.以上结果表明三岔河种群滇蛙的MMCs虽然在大小上没有变化，但在数量上却有显著的上升.

表3 两个种群滇蛙肝脏和脾脏黑色素巨噬细胞中心(MMCs)数量和大小的比较

2.4 环境因子的影响

将滇蛙成体(图2a)及蝌蚪(图2b)的血细胞微核率与水环境因子进行相关分析显示，水体水温和电导率与成体和蝌蚪的血细胞微核率均呈显著正相关关系；此外蝌蚪的血细胞微核率与水体pH值及溶氧呈显著负相关，成体的血细胞微核率与水体pH及溶氧则无显著相关性.这表明蝌蚪相较成体受环境因子的影响更大.

MR:微核率；A:海拔；pH:酸碱度；T:水温；OD:溶氧；σ:电导率；*P<0.05.

滇蛙肝脏MMCs数量与栖息地水体的水温及电导率呈现出显著的正相关关系，与海拔和水体溶氧则是显著的负相关；而肝脏MMCs面积则仅与pH呈显著负相关(图3).脾脏MMCs数量与滇蛙栖息地水体pH和电导率呈显著正相关,与海拔呈显著负相关;脾脏MMCs面积仅与电导率呈显著正相关，与溶氧呈显著负相关.MMCs的数量与水环境的电导率关系密切，表明水体溶解物影响滇蛙的免疫结构数量，其中肝脏MMCs受到环境因子的影响更大.

a：肝脏黑色素巨噬细胞中心数量；b：脾脏黑色素巨噬细胞中心数量；c：肝脏黑色素巨噬细胞中心面积；d：脾脏黑色素巨噬细胞中心面积；A：海拔；pH:酸碱度；T:水温；OD：溶氧；σ：电导率；* 表示P<0.05.

3 讨论

两栖动物细胞微核的出现是遗传结构对水环境中的外源物质做出的反应[6，19].小百户和三岔河两个滇蛙种群的血细胞中都发现了微核.无论是在成体还是蝌蚪中，三岔河种群的血细胞微核率均比小百户种群高.血细胞微核率与水体环境因子的相关分析显示，微核率与水体电导率和水温呈显著的正相关，此外蝌蚪的血细胞微核率与水体pH和溶氧呈负相关.血细胞微核率与电导率成正比，表明三岔河种群水体更高的离子浓度可能导致了滇蛙更大的DNA损伤.人类活动对水质的影响随土地利用方式的不同出现差异[20-21].农业生产活动对水质的影响较为严重，三岔河镇作为农业大镇，农药经水循环后容易进入滇蛙栖息地，而农药是引起两栖类微核率升高的重要因素[22]，因此高强度的农业生产可能是导致三岔河种群微核率较高的原因之一，这与李贞[23]和Borges[24]等的研究结果相似.微核可能也是滇蛙所产生的适应性变异之一，微核产生后细胞会启动DNA损伤反应(DNA damage response，DDR)，对微核进行修复.微核多数情况下并不会影响细胞的正常分裂[25]，但微核细胞会被优先清除[26]，滇蛙种群可能通过对生态遗传毒理抗性能力的增强来维持种群的生存，这在非洲爪蟾上已经被证实[27].

肝脏和脾脏都是水生动物体内主要的免疫器官.肝脏是蛙类体内重要的解毒器官之一，其结构受环境因子影响较大.三岔河种群部分个体的肝组织出现空泡化，空泡区内部细胞少，表明肝脏组织损伤严重，肝功能受到影响，这可能与人类高强度活动所致的水体严重污染有关.

MMCs是两栖类免疫系统的重要功能结构，能对外源有害物质做出免疫反应，还可改变黑色素形态及分布范围[28].MMCs对外源有害物质和受损细胞具有吞噬作用，且可与重金属离子进行螯合以降低对个体的损伤.三岔河种群MMCs数量显著多于小百户种群，而MMCs数量与电导率呈正相关，与溶氧呈负相关，这可能是滇蛙适应三岔河镇人类高强度农业活动所致水环境变化的方式之一.MMCs数量增加可使滇蛙增加对微核细胞的吞噬，提高自身免疫力，维持种群在人类栖息地中的生存.对泰国稻田泽陆蛙(Fejervaryalimnocharis)的研究也得到了类似的结果，农业生产会使蛙类MMCs分布范围扩大以适应环境[29].

脾脏中MMCs数量与环境因子的相关性与肝脏MMCs有所不同，可能脾脏MMCs与肝脏MMCs的生物学功能有一定差异[30]，需进一步探索.