不同糖水平饲料中添加新型植物提取物添加剂对杂交鳢生长、代谢及抗氧化能力的影响

■徐田田 黄文庆 李国立 黄燕华 许 丹 王国霞 刘兴旺

（1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.广州飞禧特生物科技有限公司，广东广州 510640；3.广东省农业科学院动物科学研究所，广东广州 510640；4.仲恺农业工程学院，广东广州 510550；5.上海牧渔科技有限公司，上海 201306）

碳水化合物（carbohydrate）又称糖类，是生物界三大基础物质之一，可为动物生长、运动、繁殖提供能源。饲料中适宜糖水平不仅可以节约蛋白质，促进生长，而且可以降低饲料成本。鱼类利用糖的能力因物种而异。芙蓉鲤鲫（Carassius auratus var Furong carp♀×Cyprinus carpio red crucian carp ♂）杂食性鱼类可利用25%～32%的糖，罗非鱼（Oreochromis niloticus）、异育银鲫（Carassiusauratus gibelio）和草鱼（Ctenopharyngodon idella）甚至可利用40%的糖来获得最佳生长。然而，肉食性鱼类可利用糖水平一般较低。研究表明，鱼类摄入过量糖会限制鱼类生长，导致机体代谢紊乱并抑制肝脏抗氧化和免疫功能。为了在饲料中有效利用糖，研究每一种养殖鱼类对糖的利用能力并探讨调控其代谢尤为重要。

杂交鳢（斑鳢♀×乌鳢♂，Channa maculata♀×Channa argus♂）是一种典型的肉食性鱼类，具有生长快、耐低氧能力强、容易摄食配合饲料、耐运输及易加工等优点，已经成为我国重要的淡水经济养殖鱼类。近年来，杂交鳢养殖规模逐步扩大，但其营养需求研究尚不全面，饲料配方主要是参考其他肉食性鱼类配方。杂交鳢对糖的耐受能力及在高糖条件下的代谢调控相关研究尚未见报道。新型植物提取物添加剂是广东省农业科学院动物科学研究所以桑叶黄酮及栗木单宁为主要原料，并复配若干功能性氨基酸而开发的一种新型植物提取物添加剂。前期研究中发现其具有消除肝糖应激、降低鱼类炎症反应及促进鱼类生长等作用。本实验以杂交鳢为研究对象，探究不同糖水平饲料中添加剂新型植物提取物对杂交鳢生长、代谢及抗氧化能力的影响，以期为杂交鳢配合饲料的科学配制提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 实验饲料

采用2×2双因子设计，以鱼粉、花生饼和豆粕为主要蛋白源，鱼油和豆油为主要脂肪源，以α-淀粉为糖源，设计糖水平分别为10%和20%、分别添加0 和0.15%的新型植物提取物添加剂（购自广州某生物科技有限公司，主要成分：桑叶黄酮65%、单宁酸30%、功能性氨基酸5%），配制成4组等氮等脂实验饲料。实验饲料配方组成及营养水平见表1。饲料原料经粉碎后过60目筛，按配方称重混匀，利用F-75型双螺杆挤条机制成直径约3.0 mm实验颗粒饲料，然后将制备的饲料在干燥、通风的室内晾干，放入-20 ℃冰箱中备用。

表1 实验饲料配方及营养水平（干物质基础，%）

1.2 实验鱼种及养殖管理

杂交鳢由广东省中山市商业农场提供。实验前挑选体质健康、大小相近、初始平均体质量为（39.35±0.01）g的杂交鳢幼鱼360尾，随机分到广东省农业科学院农业现代化科技示范区水产养殖实验基地12个网箱（1.5 m×1.5 m×2 m）中，每个网箱30 尾鱼。每种饲料投喂3个网箱，养殖为期8周，每日饱食投喂2次，分别于8：30—9：00 和16：40—17：10 各投喂1 次。实验期间，温度为27～30 ℃，氨氮≤0.1 mg/L，亚硝酸盐≤0.005 mg/L，溶解氧≥5.0 mg/L。

1.3 样品采集及分析

养殖实验结束后，禁食24 h，记录每个网箱鱼的数量和体质量。每个网箱随机取3 尾鱼装入自封袋中运至实验室，用于检测全鱼体成分。尾静脉采血，离心后取上清置于-80 ℃冰箱保存。然后，每个网箱随机抽取6尾鱼，测量体长、体质量、内脏和肝脏重量，计算肥满度、脏体比和肝体比。每个网箱分别取6尾鱼的肝脏，置于冻存管中，立即用液氮冷冻，-80 ℃冰箱中保存，用于酶活性检测。同时，从每个网箱中分别取出6 尾鱼的肝脏，保存在冻存管中，立即在液氮中冷冻，-80 ℃冰箱中保存，用于抗氧化相关基因表达分析。

按照AOAC（2005）的标准方法，分析饲料和全鱼的近似组成。水分测定为105 ℃烘干恒重法（24 h）；粗蛋白的测定为凯氏定氮法，采用瑞典TECATOR 公司1030 型蛋白质自动分析仪；粗脂肪的测定为索氏抽提法；粗灰分的测定为箱式电阻炉550 ℃灼烧法（16 h）。使用自动生化分析仪（Hitachi 7180，日本）分析血浆生化指标，包括：白蛋白、球蛋白、总蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素、血糖、胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇。所有肝脏抗氧化酶活性采用试剂盒测定（南京建成生物工程研究所有限公司）。

1.4 总RNA提取和实时荧光定量PCR

用Trizol试剂（日本TaKaRa公司）提取杂交鳢（Channa maculata♀×Channa argus♂）的肝脏总RNA。使用NanoDrop™分光光度计（美国Invitrogen 公司）测定RNA总量，A260/A280介于1.8和2.0之间被认为是纯度理想的指标。使用PrimeScript™RT Reagent 试剂盒反转录成cDNA。根据获得的核苷酸序列设计特异性RT-qPCR 引物（见表2）。引物由上海生工生物技术有限公司合成。β-actin 经稳定性验证后作为内参基因。实时荧光定量仪器为CFX96 Real-Time PCR 系统（Bio-Rad，Laboratories，Inc，USA）。用1 μL cDNA与0.5 μL 上下游引物、6 μL SYBR®premix Ex TaqTM（2×）和5 μL超纯水混合，总体积为13 μL。实时荧光定量PCR程序设定为95 ℃，30 s；40个循环95 ℃，5 s；55 ℃，30 s，72 ℃，30 s。根据2-ΔΔCt方法计算相对表达量。每个样本3个重复。

表2 实验的引物序列

1.5 指标测定与数据处理

成活率（SR，%）=实验结束活鱼总数/实验开始活鱼总数×100

增重率（WG，%）=（终末体重-初始体重）/初始体重×100

特定生长率（SGR，%/d）=（ln终末体重-ln初始体重）/天数×100

饲料系数（FCR）=总饲料用量/（终末总重-初始总重）

蛋白质效率（PER，%）=体重增加量/饲料蛋白摄取量×100

脏体比（VSI，%）=内脏团重量/鱼体重×100

肝体比（HSI，%）=肝脏重量/鱼体重×100

肥满度（CF，g/cm3）=鱼体重/鱼体长3

所有数据用“平均值±标准误（X±SE）”表示。采用SPSS 25.0统计软件进行双因素方差分析（two-way ANOVA）。当差异显著（P＜0.05）时，用Duncan’s检验进行多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 不同糖水平饲料添加新型植物提取物添加剂对杂交鳢生长性能的影响（见表3）

由表3 可知，4 个处理组的杂交鳢成活率均为100%，各处理组间无显著差异（P＞0.05）。糖水平及新型植物提取物添加剂均极显著影响杂交鳢终末均重(FBW)、增重率（WG）和特定生长率（SGR）（P＜0.01），饲料糖水平还极显著影响杂交鳢饲料系数（FCR）和蛋白质效率（PER）（P＜0.01）。20%糖组的杂交鳢生长性能极显著低于10%组（P＜0.01），添加0.15%新型植物提取物添加剂极显著改善杂交鳢生长性能（P＜0.01）。10%糖饲料中添加0.15%新型植物提取物添加剂组获得最佳的WG、SGR、FCR和PER。糖水平和新型植物提取物添加剂对杂交鳢终末体重和WG 的影响存在交互作用（P＜0.05）。脏体比（VSI）和肝体比（HSI）随糖水平升高而极显著升高（P＜0.01）。添加新型植物提取物添加剂显著影响杂交鳢HSI（P＜0.05）。10%糖水平下，0.15%添加组的杂交鳢HSI 显著低于未添加组（P＜0.05）。

表3 饲喂不同新型植物提取物添加剂和糖水平饲料8周对杂交鳢生长性能的影响

表3（续） 饲喂不同新型植物提取物添加剂和糖水平饲料8周对杂交鳢生长性能的影响

2.2 不同糖水平饲料添加新型植物提取物添加剂对杂交鳢体组成的影响（见表4）

由表4 可知，不同水平糖和新型植物提取物添加剂对杂交鳢的体组成粗蛋白、粗脂肪、灰分、钙、磷和水分影响不显著（P＞0.05），但粗脂肪随着糖添加水平从10%到20%有增加趋势，添加新型植物提取物添加剂组粗脂肪则有降低趋势。糖和新型植物提取物添加剂对杂交鳢体组成影响不存在交互作用（P＞0.05）。

表4 饲喂不同新型植物提取物添加剂和糖水平饲料8周对杂交鳢体组成的影响（g/100 g）

2.3 不同糖水平饲料添加新型植物提取物添加剂对杂交鳢血浆生化指标的影响（见表5）

由表5 可知，20%糖组的杂交鳢血浆中谷草转氨酶（AST）极显著升高（P＜0.01），三酰甘油（TG）显著升高（P＜0.05）。饲料中添加0.15%新型植物提取物添加剂显著降低了杂交鳢血浆谷丙转氨酶（ALT）活性（P＜0.05）。不同水平糖和新型植物提取物添加剂对杂交鳢血浆中白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、总蛋白（TP）、尿素、血糖、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇影响不显著（P＞0.05）。

表5 饲喂不同新型植物提取物添加剂和糖水平饲料8周对杂交鳢血浆生化指标的影响

表5（续） 饲喂不同新型植物提取物添加剂和糖水平饲料8周对杂交鳢血浆生化指标的影响(mmol/L)

2.4 不同糖水平饲料添加新型植物提取物添加剂对杂交鳢肝脏代谢和抗氧化能力的影响（见表6）

由表6 可知，高糖显著升高肝脏ALT 水平（P＜0.05），极显著升高肝脏AST 水平（P＜0.01）。同时，糖水平与植物提取物对AST 的影响存在交互作用（P＜0.01）。高糖极显著抑制杂交鳢肝脏过氧化氢酶（CAT）活性（P＜0.01），对超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性也有抑制趋势（P＞0.05）。新型植物提取物添加剂则极显著升高肝脏SOD 和CAT 活性（P＜0.01），对肝脏总抗氧化能力（TAOC）、GSH-Px 活性有升高趋势，并极显著降低肝脏丙二醛（MDA）水平（P＜0.01）。

表6 饲喂不同新型植物提取物添加剂和糖水平饲料8周对杂交鳢肝脏代谢指标的影响

2.5 不同糖水平饲料添加新型植物提取物添加剂对杂交鳢肝脏炎症因子和TOR 基因表达的影响（见表7）

由表7 可知，在不添加植物添加剂条件下，高糖水平显著抑制杂交鳢肝脏IL-1β、IL-8和TOR基因表达（P＜0.05）。由于20%糖水平条件下添加植物提取物极显著提高了IL-8的表达，因此所有糖水平组的方差分析显示20%糖水平显著上调了IL-8的表达。综合来看，添加0.15%新型植物提取物添加剂则极显著上调肝脏抗炎因子IL-10、IκBα的表达，同时也极显著上调促炎因子IL-1β、IL-8、TNF-α及TOR基因表达（P＜0.01）。但在低糖水平下，植物提取物添加对IL-8和TOR基因的表达影响不显著（P＞0.05）。植物提取物对IL-1β、IL-8及TOR基因的影响与糖水平存在极显著的交互作用（P＜0.01）。

表7 饲喂不同新型植物提取物添加剂和糖水平饲料8周的杂交鳢肝脏炎症因子和TOR基因表达的影响

3 讨论

3.1 不同糖水平饲料添加新型植物提取物添加剂对杂交鳢生长性能和体组成的影响

适宜的饲料糖水平可以促进鱼类生长、提高PER以及降低FCR。一般来说，肉食性鱼类利用糖的能力较低。本研究表明，与低糖水平（10%）相比，高糖水平（20%）极显著影响了杂交鳢WG、SGR、FCR、PER、VSI 和HSI（P＜0.01）。20%糖组的杂交鳢生长性能极显著低于10%组的（P＜0.01），这说明高糖水平饲料对杂交鳢产生显著抑制作用。该研究结果与在芙蓉鲤鲫、洛氏鱥上的研究结果一致。饲料中添加0.15%新型植物提取物添加剂后，杂交鳢的WG和SGR极显著升高（P＜0.01），HSI显著降低（P＜0.05），10%糖水平添加0.15%新型植物提取物添加剂杂交鳢组获得最佳的WG、SGR、FCR 和PER，说明添加新型植物提取物添加剂后可显著改善杂交鳢的生长性能。同时新型植物提取物添加剂能够提高蛋白质效率，减少蛋白质作为能量消耗，从而用于机体构建，这与大口黑鲈上添加了胆汁酸、肉碱等添加剂显著改善了鱼体的生长性能研究结果类似，以上结果与新型植物提取物添加剂富含桑叶黄酮等植物成分有关，桑叶黄酮在罗非鱼和凡纳滨对虾上均有促生长作用。

表6（续） 饲喂不同新型植物提取物添加剂和糖水平饲料8周对杂交鳢肝脏代谢指标的影响

在本实验中，当糖水平从10%增加到20%对杂交鳢体组成影响不显著，但杂交鳢体脂肪呈增加趋势。这可能与高水平糖在鱼体内积累转化为脂肪有关。饲料中添加0.15%新型植物提取物添加剂后，杂交鳢体组成粗脂肪呈现下降的趋势，这表明新型植物提取物添加剂具有促进脂肪代谢的作用。

3.2 不同糖水平饲料添加新型植物提取物添加剂对杂交鳢血浆生化指标和肝脏抗氧化能力的影响

血液组成与其机体自身的代谢、营养以及健康状况有着密切的联系。三酰甘油是血脂的重要组成部分，其变化可以反映脂肪在体内的部分代谢情况。本研究显示，高糖水平杂交鳢血浆三酰甘油显著升高，这可能是饲料高糖转化为脂肪后进行分解代谢而造成的。ALT 和AST 是鱼类肝脏中最重要的转氨酶。当肝细胞受到损伤时，血液中ALT 和AST的活性增高。鱼类血液中转氨酶活性的升高是鱼类体内健康状况的判断指标之一。本研究中，高糖水平杂交鳢血浆AST 活性极显著升高，肝脏ALT和AST 活性显著或极显著升高。这说明高糖饲料对杂交鳢的肝脏有损害作用。在不同糖水平饲料中添加0.15%新型植物提取物添加剂后，杂交鳢血浆和肝脏中ALT 活性均呈现下降趋势。这说明添加新型植物提取物添加剂可显著改善杂交鳢肝脏功能。

肝脏是鱼类重要的代谢器官，其抗氧化系统可以保护肝脏免受氧化剂的侵害。SOD 和CAT 等抗氧化酶在鱼类防御系统中发挥重要作用。本实验中，随着饲料中糖水平的增加，肝脏中SOD和CAT活性呈下降趋势，而MDA 呈升高趋势。这说明饲料中糖会损害杂交鳢机体抗氧化能力，饲料糖水平过高时，抗氧化酶活性显著下降，导致机体内氧化与抗氧化动态平衡的破坏。饲料添加0.15%新型植物提取物添加剂后，杂交鳢肝脏SOD 和CAT 活性极显著升高，MDA 活性极显著下降，在高水平糖饲料中对杂交鳢肝脏抗氧化能力的改善尤其明显，这表明高糖饲料中添加新型植物提取物添加剂可以缓解杂交鳢的氧化应激，增强机体抗氧化能力。

3.3 不同糖水平饲料添加新型植物提取物添加剂对杂交鳢肝脏炎症因子和TOR基因表达的影响

炎症反应是先天免疫系统应对各种刺激的重要组成部分，主要是由细胞因子介导的。IL-1β和IL-8是两种重要的促炎细胞因子，在免疫系统的炎症中发挥重要作用。在不添加新型植物提取物条件下，与低糖水平（10%）相比，高糖水平（20%）杂交鳢肝脏促炎因子IL-1β和IL-8显著下调。研究发现，IL-1β和IL-8表达下调是减轻机体组织损伤造成的炎症反应。由于肉食性鱼类的肝糖应激，饲料中高糖水平通常会直接造成肝细胞损伤。在本实验中，杂交鳢肝脏IL-1β和IL-8促炎因子下调可能并不反映机体肝脏损伤减轻，关于高糖水平对杂交鳢炎症反应的研究值得进一步研究。在不同糖水平饲料中添加0.15%新型植物提取物添加剂后杂交鳢肝脏中IL-10和IκBα抗炎因子表现出极显著上调，TNF-α、IL-1β和IL-8促炎因子均呈极显著上调，但在高糖水平肝脏IL-8促炎因子表现出极显著上调。IL-1β和IL-8在两种糖水平和新型植物提取物添加剂呈现极显著的交互作用（P＜0.01）。这说明不同糖饲料中添加新型植物提取物添加剂可以显著改善杂交鳢的免疫能力，尤其是在高糖水平（20%）时能显著改善杂交鳢免疫能力。

蛋白质合成是水产动物生长过程中的关键，TOR在这一过程中起着重要作用。蛋白质合成中的限制性步骤是翻译过程起始阶段，翻译过程起始阶段受TOR信号通路的调节。本研究显示，杂交鳢肝脏TOR的表达水平受到饲料中糖水平的显著影响。高糖水平的TOR呈显著下调，该结果与杂交鳢的生长性能的结果一致，说明高糖抑制了杂交鳢的蛋白质合成从而抑制了鱼的生长。不同糖水平饲料中添加新型植物提取物添加剂后，杂交鳢肝脏TOR表达呈显著上调，该结果与添加新型植物提取物添加剂后杂交鳢的促生长结果一致，说明新型植物提取物添加剂通过TOR 通路显著促进了蛋白质的合成从而促进鱼类生长。糖水平与新型植物提取物添加剂对TOR 的影响存在极显著的交互作用，在高糖添加条件下添加新型植物提取物添加剂可以显著增加TOR表达水平，从而改善鱼蛋白质合成以更好地促进生长。

4 结论

综上所述，适宜糖水平下（10%）添加新型植物提取物添加剂能够促进杂交鳢生长，高糖（20%）应激条件下新型植物提取物添加剂添加能够缓解高糖造成的氧化应激及炎症反应。