熔喷布固相萃取结合高效液相色谱-荧光检测法测定尿液中的1-羟基芘

乐诗文， 程冰薇， 周漪涟， 赵 琴*

(武汉科技大学公共卫生学院，职业危害识别与控制湖北省重点实验室，湖北武汉 430070)

多环芳烃(PAHs)是有机物质不完全燃烧或热解形成的污染物[1]，在环境中广泛存在。多项研究证明PAHs进入人体后产生的代谢产物具有致癌、致畸、致突变的风险[3,4]。PAHs的暴露途径多种多样，包括吸入、皮肤接触和食入等[5]，因此直接评估人群的外暴露水平存在困难。研究显示，1-羟基芘(1-OHP)是PAHs的一种综合生物标志物[7]，美国政府工业卫生学家协会(ACGIH)也将1-OHP作为PAHs生物监测的综合指标。因此，建立尿样中1-OHP快速准确、稳定可靠的检测方法，对评估人体PAHs的综合暴露水平具有重要意义。

1-OHP在尿液中通常以葡萄糖醛酸酯和芳基硫酸酯的结合态形式存在，因此，在检测前通常需要水解尿样，将1-OHP的结合态转变为游离态。此外，尿液样品基质复杂，且1-OHP在尿液中的浓度较低，为了去除尿液样品基质的干扰和提高检测方法的灵敏度，有必要对尿液进行样品前处理。目前报道的应用于尿样中1-OHP的前处理方法有液-液萃取(LLE)[7,8]、分散液液微萃取(DLLME)[9,10]、固相萃取(SPE)[11,12]、固相微萃取(SPME)[13,14]、磁固相萃取(MSPE)[15,16]等。其中，SPE作为一种成熟的样品前处理技术，具有有机溶剂消耗量低、目标分析物回收率高、基质去除效果好、无需相分离、操作简便快速等特点。普通一次性医用口罩的过滤层从内到外分别为纺粘层、熔喷层、纺粘层，其中间的熔喷层为由聚丙烯超细纤维(约1～10 μm)构成的熔喷布，其具有较大的比表面积和较好的渗透性，整体平整柔软，可填充于SPE小柱中。聚丙烯作为高分子烃基聚合物，具有较好的疏水亲油特性。基于以上特点，熔喷布可作为一种理想的SPE材料应用于生物样品中疏水性物质的分离与富集。

本研究将熔喷布作为SPE吸附材料应用于尿样中1-OHP的分离与富集。实验优化了一系列影响萃取效果的参数，结合高效液相色谱-荧光检测，建立了一种检测尿样中1-OHP的新方法，为评估人体PAHs的综合暴露水平提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器和色谱条件

Waters ACQUITYH超高效液相色谱仪(美国，Waters公司)，配FLD荧光检测器。液相色谱柱为美国Waters公司生产的ACQUITY UPLC BEH-C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相为甲醇-0.1% HAc(70/30,V/V)，等度洗脱；柱温40 ℃；流速为0.3 mL/min；进样量为10 μL。FLD激发波长(λex)为346 nm，发射波长(λem)为386 nm。

1.2 试剂与材料

HAc、(NH4)2HPO4、H3PO4、NaCl、K2SO4、NaAc·3H2O、尿素购自国药集团化学试剂(上海)有限公司，均为分析纯。甲醇、β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶购自德国默克公司。1-羟基芘(98%)、肌酐(99%)购自上海麦克林生化科技(上海)有限公司。SPE小柱(3 mL)及配套筛板购买自Biocomma(深圳)公司。

本研究中所使用到的普通医用外科口罩，分别购自青岛海诺生物工程有限公司、广西南宁北仑河医疗卫生材料有限公司、江西南昌科华医疗器械有限公司、枝江奥美医疗用品有限公司、黄冈稳健医疗用品股份有限公司。

1.3 标准系列与模拟尿液

1.3.1 标准溶液的配制准确称量10 mg 1-OHP固体于10 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，得到1 mg/mL的标准储备液，置于-20 ℃下保存。根据需要采用纯水适当稀释标准储备液为标准应用液，在后续实验中，直接将其加入模拟尿液或实际尿样中得到所需浓度的样品溶液。

1.3.2 模拟尿液的配制[17]取12.50 g NaCl、25.00 g尿素、4.05 g(NH4)2HPO4、1.20 g肌酐、1.74 g K2SO4溶解在500 mL纯水中，用H3PO4调节pH值为6.0，用纯水定容至1 L。

1.4 尿样的处理

收集志愿者的晨尿，于-20 ℃冷冻保存，使用前于4 ℃解冻。取20 mL尿样，用10 mL 0.1 mol/L HAc-NaAc缓冲溶液(pH=5.0)稀释后，加入50 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，37 ℃水解15 h。将水解后的尿液离心(4 000 r/min，5 min)后，取上清液用纯水定容至100 mL，加入8 g NaCl，用氨水调节pH至9.0，备用。

1.5 SPE步骤

口罩拆除里外两层无纺布和挂绳，保留滤芯，即可得到实验所需的熔喷布材料。将熔喷布裁剪成适当大小(20 mm×30 mm)后装入3 mL空SPE小柱中，盖上筛板并按压紧实，便可得到SPE柱。SPE小柱首先通过12 mL上样液，控制流速为5 mL/min。待上样液流出后，用3 mL纯水清洗SPE小柱，真空泵抽干残留清洗液。使用1 mL甲醇作为解吸液清洗，收集解吸液，取10 μL进行HPLC-FLD检测。SPE在Supelco12孔固相萃取装置(北京康林科技有限责任公司中国)上完成。

2 结果与讨论

2.1 不同品牌口罩中熔喷布的重现性

本研究随机采购5个品牌的医用口罩，按照“1.5”对加标模拟尿样(50 μg/L)进行前处理。结果如表1所示，目标分析物的回收率在89.1%～96.3%之间，不同品牌的熔喷布SPE小柱对1-OHP回收率的相对标准偏差(RSD)为4.8%，说明熔喷布SPE小柱的萃取性能，几乎不受生产工艺水平以及外部环境条件的影响。

表1 采用不同品牌的熔喷布作为SPE吸附剂对1-OHP的回收率

2.2 固相萃取条件优化

2.2.1 熔喷布裁剪大小为了便于熔喷布紧实地装入固相萃取小柱，需在装柱之前对熔喷布进行适当的裁剪。本研究中将整块熔喷布(150 mm×120 mm)裁剪，分别等分为3份(50 mm×120 mm)、6份(50 mm×60 mm)、9份(50 mm×40 mm)、12份(50 mm×30 mm)、30份(20 mm×30 mm)，装入固相萃取小柱中，考察其裁剪大小对1-OHP回收率的影响。实验结果表明，裁剪后熔喷布的大小对回收率的影响几乎可以忽略(图1)。原因在于熔喷布本身材质柔软，易于填充进固相萃取小柱中，因此，只要将熔喷布在固相萃取小柱中填充紧实即可获得良好的萃取效果。

图1 熔喷布裁剪大小对回收率的影响Fig.1 The influence of meltblown nonwoven fabric cutting size on the recovery

2.2.2 熔喷布质量熔喷布作为吸附剂，其用量是影响1-OHP回收率的重要因素。图2(a)显示，随着熔喷布质量的增加，1-OHP的回收率逐渐增加，在质量达到0.5 g时达到最大值，当熔喷布质量大于0.5 g时1-OHP的回收率明显降低。理论上增加熔喷布的用量可以提高1-OHP的回收率，但当解吸液体积一定时，随着熔喷布用量的增加，被解吸的1-OHP相对减少，1-OHP解吸不完全，导致回收率下降。与此同时，由于萃取材料熔喷布的质量增加，固相萃取小柱的阻力随之增大，上样液的流出速率会明显降低。综合分析，熔喷布用量选择0.5 g。

2.2.3 上样液体积上样液体积会影响富集倍数，同时也会影响1-OHP的萃取回收率。实验中考察了上样液体积在3～15 mL范围内1-OHP回收率的变化。结果显示，上样液体积小于12 mL时，随着上样液体积的增加，1-OHP的回收率也随之升高，当上样液体积超过12 mL时，1-OHP的回收率呈下降趋势，见图2(b)。最终选择12 mL作为最佳的上样液体积。

2.2.4 上样液pH和盐浓度1-OHP呈弱酸性，样品溶液的pH对其存在状态会产生较大的影响，从而影响1-OHP的回收率。在实验中用氨水和H3PO4调节上样液的pH为5～10，考察在不同的pH值下1-OHP的回收率。由图2(c)可知，在pH为5～6时，回收率基本保持不变；pH在6～9范围内，回收率显著上升；pH>9时，回收率急剧下降。这是因为熔喷布呈弱碱性，而1-OHP的萃取富集主要通过与熔喷布之间的疏水作用实现，在酸性条件下熔喷布会吸附氢离子，导致其与1-OHP的疏水作用减弱。但当样品溶液为弱碱性环境时，熔喷布疏水性较强，且1-OHP主要呈分子状态，两者之间的相互作用较强，萃取效果较好。最终选择pH为9.0，以获得1-OHP最佳的萃取效果。

在样品溶液中加盐一方面会产生盐析效应，降低目标物在样品溶液中的溶解度，有利于其与吸附剂的结合，从而提高回收率；另一方面加入盐可以影响目标分析物与萃取材料之间的相互作用从而影响萃取效率。本研究在样品溶液中加入不同质量的NaCl(0～12%)，考察盐浓度对1-OHP萃取效率的影响，结果见图2(d)。随着盐浓度的增加，1-OHP的回收率出现了先增大后减小的现象。当盐含量在0～8%时，1-OHP 的回收率逐渐提高。这是由于随着上样液盐浓度的增加，1-OHP在溶液中的溶解度降低，更容易吸附保留在萃取材料熔喷布上，此时盐浓度的升高有利于目标分析物的萃取；当盐浓度超过8%时，过量的NaCl会阻碍熔喷布与1-OHP的相互作用，导致1-OHP在熔喷布上的保留减弱，进而导致目标分析物的回收率降低。综合分析，在后续的实验中样品溶液的盐浓度选择8%。

2.2.5 解吸液的种类和体积对1-OHP的解吸是SPE的关键步骤，也是影响其回收率的重要因素。在本研究中分别使用甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和异丙醇作为解吸液来洗脱熔喷布上吸附的1-OHP，实验结果见图2(e)。根据实验结果可知，甲醇、乙醇、丙酮都可获得较高的解吸效率，其中甲醇和丙酮的解吸效果最好。但是当丙酮作为解吸液时，由于溶剂效应，其直接进入色谱分析得到的色谱峰峰底宽度较大，导致方法灵敏度下降，因此选择甲醇作为1-OHP的解吸液。本实验还同时还考察了甲醇的用量对解吸效率的影响，实验结果如图2(f)所示。随着甲醇体积从0.4 mL增加至0.6 mL，1-OHP的峰面积增大，当甲醇体积大于0.6 mL时峰面积先缓慢减小再急剧下降。1-OHP的回收率在0.4 mL到1 mL的范围内保持上升趋势并在1 mL时达到最大值。考虑到1-OHP的峰面积在0.6 mL到1 mL时相差不大，为了保证本实验拥有较高的回收率，最终选择解吸溶剂的使用量为1 mL。

图2 不同的萃取条件对回收率的影响:(a)熔喷布的量，(b)上样液体积，(c)pH，(d)盐浓度，(e)解吸液种类，和(f)解吸液体积。Fig.2 The influence of key parameters on the extraction efficiency:(a) amount of meltblown nonwoven fabrics,(b) sample volume,(c) pH,(d) salinity,(e) type of eluting solvent,and(f) volume of eluting solvent.

优化后的固相萃取条件如下：熔喷布用量0.5 g；12 mL的样品溶液作为上样液；1 mL的甲醇作为解吸液；调节上样液的pH为9，盐浓度为8%。图3曲线a为1-OHP标准溶液，浓度为100 μg/L)的色谱图，图3曲线b是用该方法测定模拟尿液中1-OHP(浓度为100 μg/L)的色谱图。从图中可明显看出，经过萃取后，1-OHP的峰面积有了大幅的增加，富集倍数为12。这表明熔喷布作为吸附剂可以有效地从尿液基质中分离并富集1-OHP，同时也显示熔喷布作为SPE材料在样品前处理中有较好的应用潜力。

图3 1-OHP标准品(100 μg/L)(a)和加标浓度为100 μg/L模拟尿液样品中1-OHP的色谱图(b)Fig.3 Chromatogram of 1-OHP standard(100 μg/L)(a) and the simulated urine sample spiked at 100 μg/L of 1-OHP (b)

此外，本研究通过重复使用同一熔喷布SPE小柱以考察其重复使用性能。将使用过的熔喷布SPE小柱，依次用2 mL甲醇和3 mL纯水进行清洗后，按照“1.5”所述方法将其循环使用5次后，1-OHP回收率仍然可以达到90%以上，显示出熔喷布SPE小柱良好的重复利用性能。

2.3 方法学考察

在上述优化的条件下，进行了线性、检出限(LOD)、定量限(LOQ)、精密度以及加标回收率的实验。考虑到模拟尿样更加易于制备，且组分更稳定，因此选择加标模拟尿样作为构建校准曲线的基质。通过在模拟尿液中添加不同浓度的1-OHP(每个浓度平行三组实验)，以得到的峰面积的平均值对样品浓度进行线性回归，得到线性回归方程及相关系数。结果表明：1-OHP在0.01～200 μg/L范围内线性关系良好，线性方程为:Y=477.24X+94.499(R2>0.9999)。LOD和LOQ值为对应于目标物信噪比(S/N)为3和10的浓度。LOD值为0.003 μg/L，LOQ值为0.01 μg/L。

方法的精密度(重现性)由日内、日间相对标准偏差(RSD)来衡量。在本研究中，在未酶解的实际尿样中分别添加低(1 μg/L)、中(5 μg/L)、高(10 μg/L)3个浓度的1-OHP。以1 d内单独配制6组平行样进行萃取，计算出日内RSD；以连续3 d，每天配制3组平行样品并进行萃取，得到3个平均值，计算3个平均值之间的相对标准偏差得到日间RSD。结果表明(表2)日内和日间RSDs分别小于5.2%和4.2%，说明该方法重现性良好。

方法的准确度由相对回收率来衡量。在本研究中，我们在未酶解的实际尿样中分别添加低(1 μg/L)、中(5 μg/L)、高(10 μg/L)3个浓度的目标分析物。以标准曲线计算出的浓度除以加标浓度乘以100%，得到相对回收率。结果显示(表2)3个浓度的相对回收率在91.7%～98.6%之间，说明本研究所建立的方法准确性良好。

表2 模拟尿液样品中3种不同浓度水平1-OHP测定的精密度(日内和日间)和回收率

2.4 与现有方法比较

将本研究中所建立的方法与文献已报道的尿样中1-OHP的检测方法进行比较，结果见表3。本研究中所提出的基于熔喷布固相萃取结合HPLC-FLD检测的方法简便、快速；此方法操作简便，无需氮吹、涡旋等耗时操作，大大提高了操作的简便性，减少了整个预处理时间，整个SPE过程可在10 min内完成。萃取过程中仅仅消耗1mL的甲醇，避免了大量有机溶剂的使用，比传统的LLE方法更环保。与此同时，本研究中所使用到的萃取材料为口罩中的熔喷布，价格低廉且材料性质稳定，优于一些合成过程复杂、稳定性较差的萃取材料，相较于传统的SPE方法更经济。此外，与其他检测方法相比，本方法的检出限和定量限更低，回收率和精密度与其他方法相当。综上所述，本方法相较于现有研究中的其他方法，更为绿色经济、简便快捷。

表3 不同方法样品前处理过程的比较。

2.5 实际样品分析

将采集到的尿样进行分析，并采用标准加入法进行确证(加标浓度为0.2 μg/L)，每个样本平行测定三次，计算检出浓度和回收率，具体数据汇总于表4。在分析检测的20份尿液样品中，有18份检测到一定含量的1-OHP，浓度范围为0.02～0.61 μg/L。实际尿液样品及加标尿液样品的色谱图如图4所示。已有研究[18]对某地区330份人尿样进行检测，得到的1-OHP的质量浓度范围为0.025～4.6 μg/L，本方法所测得的尿样中1-OHP的浓度与此结果相符。实际样品的加标回收率在88.5%～112.4%之间，表明该方法的准确性良好。以上结果也证实了本研究所建立的方法具有较好的实际应用价值。

图4 实际尿液样品(a)和实际尿液中加标浓度为0.2 μg/L的色谱图(b)Fig.4 Chromatogram of urine sample(a) and the urine sample spiked at 0.2 μg/L of 1-OHP(b)

表4 尿样中1-OHP的检测结果

3 结论

本研究将口罩中的熔喷布作为固相萃取吸附剂，结合高效液相色谱-荧光检测器，建立了一种快速测定尿液中1-OHP的新方法。该方法操作简单，无需使用大量的有机试剂，符合绿色环保的科学理念，整个预处理过程在10 min内即可完成。实验所用的萃取材料熔喷布价格低廉、易获取且性质稳定，将其应用于尿液中1-OHP的分离与富集，效果良好。此外，该方法准确度和精密度较好、实用性强、灵敏度高，可以满足尿液样品中1-OHP检测的需要。