miR-214/eNOS轴参与糖尿病大鼠肾损伤的机制研究

张芳菲 王奕雪 王 莉 刘 丽 刘东伟 王 锋 汪年松 刘章锁 梁如练

糖尿病肾病(diabetic kidney disease，DKD)是终末期肾衰竭的主要原因。调查显示，我国2018年糖尿病的发生率高达12.4%，其中约40%的2型糖尿病和30%的1型糖尿病患者最终会发展成慢性肾脏疾病(chronic kidney disease，CKD)。microRNA(miRNA)是高度保守的非编码短RNA，主要通过与靶基因mRNA 3′UTR结合而降解靶mRNA或抑制翻译参与转录后基因表达调控，在调节肾组织细胞损伤、坏死与间质纤维化等方面发挥着重要功能。miR-214是一种进化保守的miRNA，参与了急性肾损伤、CKD和DKD等多种肾脏疾病的病理生理过程。课题组前期研究发现，在高盐诱导的Dahl盐敏感大鼠中，miR-214表达显著增加，抑制miR-214明显改善了高盐诱导的蛋白尿和高血压。进一步研究表明，miR-214通过调控肾脏中的内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)参与盐敏感性高血压的发病机制。但是miR-214/eNOS轴在DKD进展中的作用机制尚不明确。本研究拟利用miR-214反义核苷酸(anti-miR-214)抑制miR-214表达，联合应用N-硝基-L-精氨酸甲酯(NG-nitro-L-argininemethylester，L-NAME)抑制eNOS活性，探讨miR-214/eNOS轴在糖尿病大鼠肾损伤的发生机制。

材料与方法

1.材料与试剂：链脲菌素(streptozotocin，STZ)(美国Sigma-Aldrich公司)，anti-miR-214和阴性对照Scrambled anti-miR(美国Exiqon公司)，L-NAME(美国Cayman Chemical公司)；尿白蛋白检测试剂盒(英国Abcam公司)， eNOS ELISA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)，Trizol(美国Invitrogen公司)，M-MLV反转录酶(美国Promega公司)，TaqMan检测试剂盒(美国Applied Biosystems公司)，2×SYBR Green Color qPCR Mix试剂盒(上海怡泽生物科技有限公司)。

2.实验动物及模型制备：所有动物实验和程序均经上海交通大学附属第六人民医院动物保护伦理学委员会批准(伦理审批号：DWLL2022-0521)。选取6～7周雄性SD大鼠72只，体质量250±20g，SPF级，购自上海市计划生育科学研究所实验动物经营部，实验动物设施许可证号：SYXK(沪)2021-0028。对SD大鼠行腹腔注射单剂量65mg/kg STZ(溶于0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液，pH 4.5)，注射3天后测空腹血糖，>16.7mmol/L提示糖尿病大鼠建模成功。

3.实验分组：(1)探讨miR-214在糖尿病大鼠肾组织中的动态变化：利用6～7周雄性SD大鼠36只，分为对照组与STZ诱导的糖尿病组，分别于糖尿病发生后0、1、2、6周处死动物，观察大鼠肾组织miR-214及尿白蛋白变化。(2)探讨miR-214是否促进糖尿病肾损伤的发生及其潜在机制：将36只大鼠随机分为对照组，STZ诱导的糖尿病模型(STZ)组，Scrambled anti-miR处理(STZ+Scrambled anti-miR)组，anti-miR-214处理(STZ+anti-miR-214)组，Scrambled anti-miR联合L-NAME处理(STZ+Scrambled anti-miR+L-NAME)组与anti-miR-214联合L-NAME处理(STZ+anti-miR-214+L-NAME)组。STZ诱导成糖尿病后7周对动物予以anti-miR-214(10mg/kg，腹腔注射，两周1次)处理；L-NAME处理组在注射anti-miR-214或Scrambled anti-miR的同时施加L-NAME。STZ诱导为糖尿病后13周处死各组动物，取血、尿与肾组织标本。

4.生化分析：按照ELISA 试剂盒说明书检测尿白蛋白和eNOS水平。

5.组织学分析：肾组织采用10%甲醛固定，经石蜡包埋，3μm 连续切片，脱蜡、水化后，行高碘酸-希夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色。随机选取10个400倍视野，用 Image J 软件测量每个视野下PAS染色阳性无核区肾小球膜基质面积，计算细胞外基质面积占肾小球面积的百分比，即肾小球系膜基质扩张系数。

6.qRT-PCR：用 TRIzol 法提取组织RNA，进一步反转录为cDNA。参照TaqMan检测试剂盒的说明方法，以5S rRNA作为内参，应用StepOnePlus定量PCR仪(美国 ABI 7500)检测miR-214的表达。其他基因mRNA，以18S rRNA为内参，按2×SYBR Green Color qPCR Mix试剂盒的说明方法进行扩增。MCP-1上游引物：5′-GTGCTGACCCCAATAAGGAA-3′，下游引物：5′-TGAGGTGGTTGTGGAAAAGA-3′；TGF-β1上游引物：5′-AATACGTCAGACATFCGGGAAGC-3′，下游引物：5′-TCAATGTACAGCTGCCGTACAC-3′；eNOS上游引物：5′-CAGCCACGTTAATTTCCACTG-3′， 下游引物：5′-GACCCTCACCGATACAACATAC-3′； 18S rRNA上游引物：5′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3′， 下游引物：5′-CCTGTATTGTTATTTTTCGTCACTACCT-3′。

结 果

1.糖尿病大鼠肾组织miR-214与尿白蛋白动态变化：糖尿病大鼠肾组织miR-214在STZ 诱导后第1、2、6周显著升高。蛋白尿在糖尿病诱导成功后的第2周开始出现，较于肾组织miR-214出现显著变化延迟了1周(<0.05，图1)。

2.anti-miR-214促进糖尿病大鼠肾小球eNOS mRNA和肾皮质eNOS 蛋白的表达：如图2所示，与对照组比较，糖尿病大鼠肾小球eNOS mRNA和肾皮质eNOS蛋白表达明显增加(<0.05)。抑制miR-214表达可进一步上调肾小球eNOS mRNA和肾皮质eNOS蛋白水平(与STZ+Scrambled anti-miR组比较，<0.05)；eNOS抑制剂L-NAME不影响anti-miR-214对eNOS的表达调控(与STZ+Scrambled anti-miR+L-NAME组比较，<0.05)。

3.miR-214/eNOS轴参与糖尿病大鼠蛋白尿的发生：如图3所示，与对照组比较，糖尿病大鼠空腹血糖和尿白蛋白水平明显增加(<0.05)；利用anti-miR-214抑制miR-214表达明显减轻糖尿病大鼠蛋白尿(<0.05)，但不影响血糖水平(>0.05)。进一步研究显示，eNOS抑制剂L-NAME使anti-miR-214对糖尿病大鼠蛋白尿的保护作用消失(与STZ+Scrambled anti-miR+L-NAME组比较，>0.05)，这提示miR-214通过调控eNOS参与糖尿病大鼠蛋白尿的发生。

4.miR-214/eNOS轴参与糖尿病大鼠肾损伤：如图4所示，与对照组比较，STZ诱导的糖尿病大鼠体质量减轻，肾肥大指数增加，系膜基质增生(<0.05)。anti-miR-214显著减轻糖尿病大鼠肾肥大，改善系膜基质增生(与STZ+Scrambled anti-miR组比较，<0.05)，但对糖尿病大鼠体重无显著影响(>0.05)。eNOS抑制剂L-NAME使anti-miR-214对糖尿病大鼠的肾脏保护作用消失(STZ+anti-miR-214+L-NAME组与STZ+Scrambled anti-miR+L-NAME组比较，肾肥大指数和肾小球系膜扩张系数差异无统计学意义，>0.05)，这提示miR-214通过调控eNOS参与糖尿病大鼠肾损伤机制。

5.miR-214/eNOS轴调控糖尿病大鼠肾组织TGF-β1和MCP-1的表达：如图5所示，与对照组比较，糖尿病大鼠的肾皮质TGF-β1和MCP-1表达显著增高(<0.05)。anti-miR-214抑制了TGF-β1和MCP-1的表达(与STZ+Scrambled anti-miR组比较，<0.05)，eNOS抑制剂L-NAME显著抑制了anti-miR-214介导的TGF-β1和MCP-1表达上调(与STZ+Scrambled anti-miR+L-NAME组比较，>0.05)，这提示miR-214通过调控eNOS参与调节糖尿病大鼠肾组织TGF-β1和MCP-1的表达。

讨 论

本研究表明，糖尿病大鼠肾组织miR-214表达明显上调。抑制miR-214表达减轻了糖尿病大鼠白蛋白尿，肾肥大和肾小球系膜基质增生，其机制可能是通过上调eNOS表达，达到保护糖尿病肾损伤的作用。

miR-214是一种重要的miRNA，在多种肾损伤模型中被显著上调。笔者发现糖尿病大鼠肾组织中高表达，抑制miR-214改善了糖尿病肾损伤。糖尿病肾病早期主要表现为持续的微量白蛋白尿。本研究发现，anti-miR-214可以降低糖尿病大鼠蛋白尿，但对血糖无影响，表明anti-miR-214介导的肾保护作用与血糖调控机制无关。肾小球肥大和系膜外基质积聚是DKD的重要特征。

TGF-β1是一种重要的促纤维化因子，它调控系膜细胞肥大，增加胶原蛋白合成，促进系膜外基质积聚，最终导致糖尿病肾病肾小球硬化。MCP-1也被报道直接参与细胞外基质合成，并在糖尿病肾病的发病机制中发挥重要的促炎作用。笔者研究发现，anti-miR-214可显著减轻糖尿病大鼠肾肥大，改善肾小球系膜基质增生，同时下调肾组织TGF-β1与MCP-1的表达水平。

已有研究表明，miR-214通过抑制PTEN表达加重db/db小鼠肾小球系膜肥大和细胞外基质积聚。笔者既往研究表明，除PTEN外，eNOS也是miR-214的靶标，参与miR-214对血压的调控。内皮功能障碍是DKD早期病理异常的标志，eNOS是内皮细胞合成NO的限速酶，其功能失调或表达降低会导致内皮功能障碍。与野生型小鼠比较，eNOS敲除的糖尿病小鼠表现出更明显的白蛋白尿和肾小球病变。临床研究表明，eNOS基因多态性与糖尿病肾病的发生风险相关。本研究显示，在糖尿病大鼠肾活检中肾小球eNOS表达增高，抑制miR-214上调了糖尿病大鼠肾组织eNOS水平并改善糖尿病肾损伤。此外，eNOS抑制剂L-NAME使anti-miR-214对糖尿病大鼠的肾脏保护作用消失，提示miR-214可能通过抑制eNOS表达参与DKD的发生和发展。

综上所述，本研究结果表明，miR-214/eNOS轴可能参与了糖尿病大鼠肾损伤的分子机制；抑制miR-214的表达可减轻糖尿病肾损伤，为临床DKD防治提供了新思路。在本研究使用了STZ诱导的糖尿病大鼠模型来探讨anti-miR-214的肾保护作用，该模型无法完全模拟临床糖尿病肾病。未来需要进一步使用更理想动物模型、基于更大的样本量开展miR-214/eNOS轴参与糖尿病肾损伤的分子机制研究。