液相色谱串联四极杆线性离子阱质谱测定秸秆发酵饲料中米酵菌酸和毒黄素

索德成， 肖志明， 张 晶， 王 石， 冯玉超，3， 管 鑫，3， 李 阳， 樊 霞*

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081；2.福建省农产品质量安全检验检测中心，福建福州 350003；3.黑龙江八一农垦大学，黑龙江大庆 163000）

椰毒假单胞菌是一种致死率很高的病原菌，此菌主要产生2种毒素：米酵菌酸（Bongkrekic acid）和毒黄素 （Toxoflavin）（田凤丽等，2017；Buckle等，1990；Nugteren等，1957）。米酵菌酸可以与细胞中的线粒体ADP/ATP转运体结合，阻止ADP的转移，并且其对人、动物有毒性作用，可引起中毒性肝炎、中毒性肾病等，从而导致脏器损伤，动物中毒症状为萎顿、竖毛、平衡障碍，濒死时有抽搐等现象（刘莹等，2003）。毒黄素可以直接作用与细胞内的电子传递链，影响呼吸作用并产生大量的有毒的过氧化氢分子，对人、动物皆有毒性作用，主要为急性中毒，中毒后会出现呼吸急而深，全身震颤、抽搐，血尿或血色素尿等现象 （翁晨辉等，2017；Hellendoorn等，1961），与米酵菌酸共同作用，可以引起细胞死亡。刘秀梅等（1991）从干玉米叶中分离到9株椰毒假单胞菌酵米面亚种，并在其产毒培养物中检出米酵菌酸；赵晋等（1997）也从发酵玉米中检出米酵菌酸。秸秆发酵饲料是以玉米、甜高粱等为原料，经微生物发酵加工而成的饲料，已广泛应用于反刍动物的饲养中，在单胃动物饲粮中也有一定的应用（韩明鹏等，2010；杨永明等，2002）。因此对发酵饲料中米酵菌酸和黄毒素的风险进行监测和评估具有重要意义。

目前，国内外关于米酵菌酸和黄毒素检测方法大多集中于食品领域，包括生物传感测定法、薄层色谱法、高效液相色谱法及高效液相色谱质谱法等。生物传感器法利用其β-半乳糖苷酶活性测定毒黄素浓度，抗干扰能力较弱，需要较好的净化手段（刘倩妤等，2020；Choi等，2013）。薄层色谱法的前处理较为复杂、有机试剂的消耗量大、基质干扰多、结果回收率低，不适用于批量样品的检测分析（Nugteren等，1957），国家标准GB 5009.189修订时删除了薄层色谱法。液相色谱法因饲料样品基质复杂所致，对前处理过程的要求较高，检测限也较高，无法满足痕量分析要求（沈潇冰等，2018；李红艳等，2016；Voragen等，1982）。近年来，应用LC-MS/MS进行米酵菌酸和毒黄素检测的研究日趋增多，配合简单的前处理过程即可满足痕量检测要求（王俊虎等，2020；Liang等，2021；曾令浩等，2019；周鹏，2015），但缺乏秸秆发酵饲料中米酵菌酸和毒黄素的同步分析方法。为此，本研究利用多重吸附前处理技术，配合液相色谱串联四极杆线性离子阱质谱，旨在建立同步检测秸秆发酵饲料中米酵菌酸和毒黄素的方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂AB SCIEX Triple Quad 6500+型液相色谱串联四极杆线性离子阱质谱仪（美国AB SCIEX公司）：配有电喷雾电离源（ESI源），米酵菌酸标准品（纯度＞98%）：购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；黄毒素标准品（纯度＞98%）：购自美国Target Molecule公司；乙腈和甲醇：色谱纯，购自德国Fisher ChenAlert Guide公司；其他试剂：均为分析纯，购自北京化学试剂公司；试验用水：经Milli-Q纯化制备的一级水（＞18.2 MΩ）。0.22 μm尼龙滤膜：购自上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 实验材料 前处理吸附材料：HLB填料购自深圳逗点科技有限公司；Carb填料、Al-N填料、C18填料购自天津博纳艾杰尔科技公司；PSA填料、Carb填料、SCX填料、SAX填料购自美国安捷伦科技有限公司；纳米碳（Nano Carb）（粒径10～20 nm）购自先锋纳米有限公司。具体材料类型等相关信息参见表1。

表1 吸附材料名称与类型

多重吸附前处理吸附材料的制备：称取2 g HLB填料和3 g Al-N填料于50 mL三角瓶中，混合均匀，备用。

实验用秸秆发酵饲料样品由国家饲料质量检验检测中心（北京）提供，采集于使用秸秆发酵饲料的养殖场或生产企业。

1.3 样品前处理 准确称取2 g秸秆发酵饲料样品（精确至0.01 g），加入20 mL 1%甲酸溶液+乙腈溶液（15+85），振荡提取30 min，于10000 r/min条件下离心5 min，取上清液备用。

移取3 mL上清液，置于10 mL离心管中，加入100 mg多重吸附前处理吸附材料和500 mg无水硫酸镁，漩涡混合30 s，于10000 r/min条件下离心2 min；将上清液转移至10 mL离心管中，在40℃温度下用氮气吹至近干，加入0.5 mL乙腈+0.1%甲酸水溶液（10+90），漩涡混合30 s，过0.22 μm滤膜，上液相色谱串联四极杆线性离子阱质谱测定。

1.4 色谱和质谱条件 色谱柱：Waters BEH C18柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）；柱温：35℃；进样量：10 μL；流动相流速：0.3 mL/min，梯度淋洗。流动相组成及洗脱梯度条件见表2。质谱采用电喷雾电离源（ESI）正负离子切换模式进行分段采集，0～3 min为正离子检测模式，用于测定毒黄素；3～5 min采用负离子模式，用于测定米酵菌酸。喷雾电压为4.5 kV；毛细管温度为420℃；脱溶剂气和碰撞气均为高纯氮气，气量分别为50 arb和30 arb。具体参数见表3。

表2 流动相梯度条件

2 结果与分析

2.1 色谱和质谱条件的优化 用微量注射泵直接将米酵菌酸和毒黄素标准溶液（50 ng/mL）注入质谱仪，分别在正负离子模式下进行全扫描，以确定米酵菌酸和毒黄素的分子离子峰，米酵菌酸在负离子模式下有很高的响应值，其主要的分子离子峰为[M-H]－；毒黄素在正离子模式下响应值高，其主要的分子离子峰为[M+H]+。分别在各自的检测模式下对其子离子进行全扫描，获得二级质谱响应较强的子离子；然后进行优化，获得去簇电压（DP）和碰撞能量（CE）等相关参数，具体参数参见表3。

表3 米酵菌酸和毒黄素的质谱条件

目前，采取液相色谱检测米酵菌酸和毒黄素的报道中多数采用以甲酸或乙酸水溶液为水相，以甲醇或乙腈为有机相的基本流动相条件。为此，本实验参考上述流动相条件进行研究，结果表明，使用0.1%甲酸乙腈溶液作为流动相进行梯度洗脱，待测物质的色谱峰型和出峰稳定性较好，可以在6 min内有效分离2种目标化合物，节省了溶剂消耗，降低了分析成本和废液产生。具体色谱图见图1。

图1 米酵菌酸和毒黄素定量离子色谱图

2.2 提取条件选择 米酵菌酸和黄毒素的结构和性质差异较大。米酵菌酸是一种脂类毒素，易溶于有机溶剂中（方力等，2022）；毒黄素属水溶性黄色素，不溶于石油醚、乙醚和二甲苯等有机溶剂中，但在甲醇、乙腈、氯仿、二甲基亚砜具有一定的溶解性。本实验以秸秆发酵饲料为基质，考察了甲醇、乙腈、氯仿、二甲基亚砜、乙腈+甲酸溶液、乙腈+氨水溶液、乙腈+水溶液的提取效果。实验时，称取空白秸秆发酵饲料2 g，加入0.1 mL 1 μg/mL米酵菌酸与毒黄素标准溶液，加入20 mL不同类型的提取溶剂，漩涡振荡提取30 min，在10000 r/min条件下离心5 min。取上清液过膜，上机检测，每组实验重复3次，计算回收率。分析结果如图2所示。

图2 不同溶液提取秸秆发酵饲料中米酵菌酸和黄毒素的效果对比

由图2可知，甲醇有较好的提取能力，但也同时存在会萃取出多种其他成分而产生基质干扰的情况，不利于下一步净化。二甲基亚砜提取时，提取液中含有大量蛋白和色素等杂质，影响定性与定量的效果；同时污染色谱柱，结果回收率较低。氯仿对毒黄素的提取效果较好，但是对米酵菌酸的提取效果较差。乙腈对两种毒素均有较好的提取能力，因此选用乙腈作为有机萃取剂。为了进一步提高回收率，适量加入甲酸或氨水溶液，加入一定比例的水溶液后，毒黄素和米酵菌酸的回收率可以达到80%以上，原因可能是毒黄素的水溶解性强、水能有效提取秸秆发酵饲料中毒黄素，同时水能提高有机溶剂对米酵菌酸的渗透性，从而提高对米酵菌酸提取效率（方力等，2022）。采用乙腈+氨水提取时，目标物米酵菌酸与溶剂中的NH4+离子结合，导致回收率降低。采用乙腈+甲酸溶液作为提取剂时，毒黄素和米酵菌酸的回收率均可以达到80%以上。综合以上分析，本研究最终选择20 mL 1%甲酸溶液+乙腈（15+85）溶液作为提取溶液。

2.3 多重机制杂质吸附净化的条件选择 目前常用固相萃取柱和QuEChERS净化米酵菌酸或毒黄素（Liang，2021；周鹏，2015），然而由于毒黄素分子质量小，研究过程中发现无法使用固相萃取柱进行有效富集和净化，同时常用的QuECh-ERS材料如PSA、C18对在秸秆发酵饲料样品的净化效果一般，需要找到或研发新的填料用于米酵菌酸或毒黄素的净化去除杂质。为此，本研究中选择10种常见的不同净化填料，探索对秸秆发酵饲料中米酵菌酸或毒黄素的净化回收效果。具体实验步骤如下：称取空白秸秆发酵饲料20 g，加入200 mL 1%甲酸溶液+乙腈溶液（15+85），振荡提取30 min，在10000 r/min条件下离心5 min，将上清液转移至试剂瓶中备用。分别吸取3 mL提取液，加入0.3 mL 1 μg/mL米酵菌酸与毒黄素标准溶液，再分别加入100 mg各种吸附材料，漩涡混合30 s，在摇床上振荡15 min，10000 r/min条件下离心5 min，取上清液过膜，上机检测；同时吸取3 mL提取液，不加入吸附材料作为空白参考。每组实验重复3次，用测定值与空白参考比值计算回收率，并以此比较吸附效果，结果见图3。

图3 不同吸附剂对米酵菌酸与毒黄素吸附能力比较

从图3可以看出，吸附材料能吸附部分干扰物质，降低了样品的基质效应，使处理后回收率高于空白提取液；但FL吸附材料对米酵菌酸有明显的富集作用（回收率＞100%），但对毒黄素吸附率不到50%，不宜作为富集材料使用；而使用HLB填料和Al-N填料进行吸附后，检测结果具有较好的回收率。其中，HLB填料是亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，亲脂性的二乙烯基苯结构保留非极性化合物，亲水性的N-乙烯基吡咯烷酮结构保留极性化合物，使得该填料具有良好的吸附杂质性能；Al-N填料为中性氧化铝，主要作用机理为物理吸附，可去除部分重金属、部分色素和酯类物质。综合实验结果和理论分析，选择HLB和Al-N作为多重机制杂质吸附的组成材料，通过混合使用，可以有效的去除秸秆发酵饲料提取液中的各种杂质干扰，达到更好的净化效果。因此，本研究最终采用多重机制杂质吸附技术（MIA）来净化样品。将各种材料按不同比例添加进行净化研究，从基质净化效果来看，HLB和Al-N的比例为1:1，能有效地吸附杂质，从而降低基质效应。当加入吸附剂吸附净化后，在有效地除去基质中的干扰物对待测物色谱峰的影响的同时，还可以减少杂质对仪器和色谱柱的损害。

在此基础上，本研究考察了吸附材料的不同使用量对样品净化效果的影响，比较了不同固体吸附剂添加量（10、20、50、100、200、500 mg）对秸秆发酵饲料提取液中杂质净化效果的影响。结果表明，当固体吸附材料加入量达100 mg时，溶液色泽明显变浅；但继续加大吸附剂的用量，对秸秆发酵饲料样品杂质的净化效果无明显改善。因此，将吸附材料加入量设定为100 mg。

2.4 基质标准曲线线性方程和检出限，定量限不同秸秆发酵饲料样品的组成比较复杂，使用液相色谱-串联质谱进行检测时基质干扰非常明显，对标准溶液进行标准曲线的线性关系进行研究时，需针对特定基质进行。取空白秸秆发酵饲料样品进行前处理，以此基质提取液作稀释液配制混合标准溶液，与直接用定容液配制的标准溶液对比，结果毒黄素呈现基质抑制效应，米酵菌酸无明显基质效应。为消除基质效应，本实验绘制基质校正标准曲线来进行定量。取空白样品进行前处理后，配制米酵菌酸与毒黄素浓度为1、2、5、10、20、50、100 μg/L的基质混合标准溶液，以定量离子色谱峰面积与基质混合标准溶液的浓度作标准曲线，计算结果见表4。可见基质混合标准溶液在1.0～100 μg/L内线性关系良好。设定定量离子色谱峰的3倍信噪比（S/N）为检出限（LOD），10倍S/N为定量限（LOQ），得出米酵菌酸与毒黄素的LOD和LOQ。

表4 米酵菌酸与毒黄素线性方程、LOQ和LOQ

2.5 回收率和精密度 称取2 g空白样品，添加适量米酵菌酸与毒黄素标准溶液，制备米酵菌酸与毒黄素添加水平分别为5、100、1000 μg/kg的秸秆发酵饲料样品，每个添加水平制备18份样品，按本研究建立的方法，每天测定6份，连续测定3 d，计算其日内和日间回收率，及其相对标准偏差（RSD），结果见表5。

表5 回收率与精密度实验结果

结果显示，本方法回收率为82.8%～102.0%，相对标准偏差小于15.0%，满足饲料分析方法的要求。

2.6 实际样品检测 按上述方法对50份秸秆发酵饲料样品进行检测，其中6份样品中检出米酵菌酸或毒黄素，其中米酵菌酸含量为3.5～56.7 μg/kg，毒黄素含量为5.3～14.6 μg/kg，其含量差异比较明显，部分秸秆发酵饲料样品中2种毒素同时有检出。

3 结论

本研究建立了利用多重吸附技术结合液相色谱串联四极杆线性离子阱质谱（LC-MS/MSQTRAP）测定秸秆发酵饲料中米酵菌酸和毒黄素含量的方法。该方法前处理简单，线性良好，回收率和相对标准偏差、方法检出限、方法定量限均能满足秸秆发酵饲料中毒素含量检测的要求。采用建立的方法对实际样品进行检测，部分秸秆发酵饲料中检出米酵菌酸和毒黄素，结果表明，秸秆发酵饲料中米酵菌酸和毒黄素存在安全风险的情况，应尽快制定相应的检测标准和限量要求，防止因动物饲料传递造成的畜产品质量安全。