绿肥油菜复种棉花对土壤细菌和团聚体的影响

董章辉，王虎，张艳丽，赵丽芬，眭书祥，李增书，高驰，朱青竹

（石家庄市农林科学研究院，河北石家庄 050041）

土壤是农业生产的基础，土壤微生物在土壤生态系统中发挥着非常重要的作用。土壤微生物不仅参与土壤中养分的分解、转化和循环，而且影响土壤结构、土壤肥力和植物健康，对维持土壤生态结构和功能正常至关重要［1-2］。近年来，大量施用化肥对我国土壤质量和生态造成严重影响，使土壤微生物多样性和菌群数量下降，土壤容重增加，土壤结构稳定性受到影响［3］。

绿肥是重要的有机肥，不仅可以提高土壤有机质含量，改善土壤理化性质，而且可以提高土壤微生物种群数量和活性，改善土壤微生物种群结构。祖韦军等［4］研究了耕作深度和不同绿肥对植烟土壤微生物功能多样性和酶活性的影响，结果发现光叶紫花苕、黑麦草和油菜作绿肥均能提高土壤微生物功能多样性及土壤酶活性，且光叶紫花苕深耕表现最好。赵冬雪等［5］研究了套作绿肥对植烟土壤微生物菌群结构及功能多样性的影响，表明套作绿肥改变了微生物菌群结构，提高了菌群多样性，增强了微生物碳源应用能力。周德平等［6］研究表明绿肥油菜还田量与土壤细菌数量和下茬水稻产量呈高度正相关。Muhammad 等［7］研究表明，大麦和光叶紫花苕绿肥可以有效提高土壤中细菌和真菌的种类和数量。宋佳等［8］研究表明冬种绿肥和秸秆还田可以提高土壤中大团聚体、超大团聚体和有机碳的含量，提升土壤团聚体和有机质的稳定性。袁苗苗等［9］利用9 个不同油菜品种研究了油菜压青对土壤团聚体及腐殖质结合形态的影响，结果表明绿肥油菜可以提高土壤大团聚体含量、土壤松紧比和松稳比，提高土壤各结合形态腐殖质含量及团聚体对土壤有机质的贡献率。土壤微生物与土壤团聚体相互作用，密切相关，土壤微生物是土壤团聚体形成和稳定的重要影响因素，土壤团聚体结构直接影响土壤肥、水、热、气和土壤养分，进而影响土壤微生物菌群结构［10-12］。

油菜作为绿肥生物量大，肥效好，而且生育期短，与早熟棉可以直播复种，栽培管理简单，经济效益和生态效益显著。近年来，绿肥油菜与棉花复种的栽培模式已有应用，然而其对土壤微生物菌群组成及土壤团聚体结构的影响研究较少。本研究连续3 年绿肥油菜压青后复种棉花，分析了该复种模式对土壤细菌菌群组成、多样性和功能的影响及对土壤团聚结构的改良效果，以期为该复种模式对土壤改良效果提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地情况

试验地点位于河北省邯郸市曲周县西漳头村（东经115o1'2''，北纬36o47'23''），供试土壤质地为黏土，地势平坦、地力中等、肥力均匀。土壤基本理化性状为：有机质含量17.73 g·kg-1，全氮含量1.19 g·kg-1，碱解氮含量66.33 mg·kg-1，有效磷含量24.42 mg·kg-1，速效钾含量362.33 mg·kg-1，pH值8.17，电导率235 μS·cm-1。

1.2 试验材料与设计

油菜品种选用沣油958，为甘蓝型油菜品种；棉花品种选用早熟棉品种冀石929。2018-2020年，连续3 年在曲周县西漳头村试验基地开展绿肥油菜与棉花复种试验，油菜压青后复种棉花，同时设置单作棉花为对照。2020 年开展田间区组对比试验，设油菜压青（YQ）和对照（CK）2 个处理，3 次重复，小区面积为222.2 m2。油菜压青处理：绿肥油 菜 在3 月5 日 播 种，播种量 为9 kg·hm-2，5 月15日压青，翻压深度25 cm 以上，5 月25 日播种棉花，密度为90 000 株·hm-2，不盖地膜；对照：单作棉花，不种绿肥油菜。各小区在棉花播种前施入45%复合肥（15-15-15 N-P2O5-K2O）作为底肥，施用量为150 kg·hm-2。

1.3 土壤微生物测定和分析

2020 年第3 年绿肥油菜与棉花复种试验期间，油菜压青60 d 后在YQ 和CK 处理的每小区15 cm耕作层，利用三点取样法取土样。土样委托北京百迈克公司提取样品总DNA，基于细菌16S rDNA 进行高通量测序，每个土样检测1 次，每个处理3 次重复。

从原始数据中导出测序序列，使用Limav1.7.0 软件进行识别、过滤，使用UCHIME v4.2 软件鉴定并去除嵌合体序列，得到有效序列；使用Usearch 软件［13］在97%的相似度水平下进行聚类，获得基本分类单元（OTU），并基于Silva 分类学数据库对OTU 进行分类学注释。在门、纲、目、科、属、种各分类水平上进行分类，统计比较各等级的物种类型数目。以测序序列数与OTU 物种数构建稀释性曲线［14］，利用Mothur 软件和R 语言工具依据各样品的测序量在不同测序深度的Shannon 指数（反映样品中微生物多样性的指数）绘制Shannon 多样性指数稀释曲线。将OTU 序列与微生物参考数据库进行比对，得到每个OTU 对应的物种分类信息，在门、纲、目、科、属、种各分类水平上的不同物种进行相对丰度分析。通过Bug-Base 表型分析［15］，在门水平上对样品土壤中好氧性、厌氧性、兼性厌氧性、革兰氏阴性、革兰氏阳性、致病性、生物膜形成、胁迫耐受性和移动元件等表型的物种相对丰度进行分析。

1.4 土壤团聚体结构测定与分析

2020 年第3 年绿肥油菜与棉花复种试验期间，选取油菜压青后30 d 和60 d，在压青和不压青处理的每个小区利用三点取样法取15 cm 耕作层土样，利用湿筛法测量土壤水稳性团聚体结构［16］。测定0.5～2 mm 和0.25～0.5 mm 大 团聚体，0.053～0.25 mm 小团聚体和小于0.053 mm 黏粒等4 个粒级的质量百分含量，计算土壤团聚体平均质量直径（MWD），公式如下：

式中，Xi表示第i 个粒径团聚体的平均直径/mm，Wi表示第i 个粒径团聚体的质量百分数/%。

所得数据采用Excel 2010 进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 油菜压青对土壤细菌菌群多样性的影响

油菜压青和不压青地块分别取土样提取DNA，基于16S rDNA 进行高通量测序。测序后共得到78 048 条有效序列，其中对照土样39 027条，压青土样39 021 条。使用Usearch 软件，将有效序列在97%相似度水平下与数据库比对，进行聚类，划分OTU。结果，对照土壤中共得到1583个OTU，油菜压青土壤比对照中减少50 个OTU，同时增加92 个新的OTU，达到1625 个。压青处理和对照土壤中共同拥有的OTU 为1533个（图1）。

图1 压青和不压青土壤中细菌种群OTU 物种多样性分布Fig.1 The distribution of OTU diversity in the treatments with（YQ）/without（CK）rapeseed as green manure

以测序序列数与OTU 物种数来构建稀释性曲线，验证测序数据量是否足以反映样品中的物种多样性。利用Mothur 软件和R 语言工具依据各样品的测序量在不同测序深度时的Shannon 指数绘制Shannon 多样性指数稀释曲线，以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。结果如图2 所示：随着测序数的加大稀释性曲线趋于平缓，表示此环境中的物种并不会随测序数量的增加而显著增多，表明测序序列数充分，可以进行数据分析；Shannon 指数曲线趋向平坦后，油菜压青样品Shannon 指数高于对照，说明油菜压青增加了土壤中细菌物种的多样性。

图2 压青和不压青细菌OTU 稀释性曲线和Shannon 指数曲线Fig.2 Soil bacteria OUT dilution curve and Shannon index curve of the YQ and CK treatments

基于OTU 分析结果对样品在门、纲、目、科、属、种各分类水平上统计比较各等级的物种类型数目。由表1 可以看出，油菜压青后细菌在门、纲、目和科分类水平上细菌物种类型数目稍有减少，但差异不明显；属和种水平上细菌物种类型数目增多，且差异达到显著水平。

表1 压青和不压青土壤中细菌各等级物种OTU 数量统计Table 1 The OTU number of per level species in the treatments of YQ and CK

2.2 油菜压青对土壤细菌菌群组成影响分析

将OTU 序列与微生物参考数据库进行比对，得到每个OTU 对应的物种分类信息。对油菜压青和不压青土壤在门、纲、目、科、属、种各分类水平上，对细菌不同物种进行相对丰度分析、比较，并对相对丰度前10 的物种菌群绘制相对丰度分布柱状图。由图3 可以看出，在门水平上，相对丰度前10 的优势菌群在对照和压青土壤中分别达到80.0%和82.2%，其中变形菌门（Proteobacteria）、Acidobacteriota 门和拟杆菌门（Bacteroidota）为优势菌群，油菜压青后Acidobacteriota 门相对丰度显著降低，放线菌门（Actinobacteriota），蓝藻菌门（Cyanobacteria）相对丰度显著升高；在纲分类水平上，相对丰度前10 的优势菌群在对照和压青土壤中分别达到69.0%和70.1%，其中γ-变形杆菌纲（Gammaproteobacteria）、拟杆菌纲（Bacteroidia）和Vicinamibacteria 纲为优势菌群，油菜压青后Vicinamibacteria 纲相对丰度显著降低，浮霉菌纲（Planctomycetes）相对丰度显著升高；在目水平上，相对丰度前10 的优势菌群在对照和压青土壤中分别达到52.8%和50.3%，其中Burkholderiales、Vicinamibacterales 和Chitinophagales 为 优 势 菌 群，油 菜压青后Vicinamibacterales 相对丰度由12.3%降低为8.5%，显著降低；在科水平上，相对丰度前10 的优势菌群在对照和压青土壤中分别达到37.8%和35.8%，Vicinamibacteraceae 和 Chitinophagaceae为优势菌群，其中Vicinamibacteraceae 相对丰度最高，且压青后显著降低；在属和种水平上，相对丰度最高的菌群分别为Vicinamibacter和Vicinamibacter_silvestris，且压青后均显著降低。

图3 压青和不压青土壤细菌各分类水平菌群物种相对丰度分布Fig.3 The relative abundances of each species of the bacterial community in YQ and CK treatments

2.3 油菜压青后门水平细菌功能分析

通过BugBase 功能分析，在门水平上对压青和不压青土壤中好氧性、厌氧性、兼性厌氧性、革兰氏阴性、革兰氏阳性、致病性、生物膜形成、胁迫耐受性和移动元件等表型的物种相对丰度进行分析。由图4 可以看出，好氧性、革兰氏阳性、胁迫耐受性和移动原件表型的物种丰度明显提高，厌氧性和致病性表型物种丰度降低。其中，压青后好氧性表型的浮霉菌门（Planctomycetes）和变形菌门（Proteobacteria）相对丰度提高；革兰氏阳性表型的放线菌门（Actinobacteriota）丰度显著升高；厌氧性表型和致病性表型的酸杆菌门（Acidobacteria）相对丰度显著降低。

图4 压青和不压青土壤细菌门水平BugBase 功能分析Fig.4 BugBase function analysis at phylum level for YQ and CK

2.4 土壤团聚体结构分析

团聚体是土壤结构的基本单元，是土壤肥力和作物产量的主要影响因素，在调节土壤保水性和通气性，维持土壤肥力，减缓土壤侵蚀等方面起重要作用［17］。连续3 年绿肥油菜压青后，我们在2020 年油菜压青30 d 和60 d 取15 cm 耕作层土样用湿筛法测量土壤团聚体结构，同时以不压青土样作为对照。结果显示（表2）：油菜压青后，大团聚体质量百分含量提高，其中0.5～2 mm 粒级大团聚体在压青30 d 和60 d 提高均达到显著水平，0.25～0.5 mm 粒级大团聚体在压青30 d 提高达到显著水平；压青后，0.053～0.25 mm 粒级微团聚体质量百分含量降低，在压青30 天和60 天均达到显著水平；＜0.053 mm 粒级黏粒质量百分含量稍有降低，但没有达到显著水平。另外，与对照相比土壤团聚体平均质量直径在油菜压青后有明显提高，且30 d 和60 d 均达到显著水平。这说明油菜压青有利于土壤中小团聚体向大团聚体转化，提高土壤团聚体稳定性，改善土壤团聚体结构。

表2 油菜压青对土壤团聚体质量百分含量和平均质量直径的影响Table 2 The analysis of the difference of mass percentage of soil aggregates and mean weight diameter between YQ and CK

3 讨论

农业田间管理对土壤微生物有较大影响，施肥方式、耕作深度、作物轮作、和翻压绿肥等都会影响土壤微生物特性。绿肥还田为微生物提供了充足的碳源，创造了一个营养充足的土壤生态环境，促进更多的微生物生长。已有研究表明翻压绿肥有利于提高土壤细菌菌群多样性，改变其相对丰度分布［5-6］，本研究进一步表明绿肥油菜与棉花复种栽培模式也可以有效提高土壤中细菌物种的多样性，在门、纲、目、科、属、种各个分类水平上统计、比较物种多样性，进一步发现油菜压青使细菌多样性在属和种水平有更明显提高。土壤微生物多样性参与着土壤生态系统的互作，在营养物质分解，流动和循环过程中发挥重要作用，土壤中高水平的微生物多样性有利于土壤质量的提高［18-19］。另外，本研究分析了细菌不同分类水平上的优势菌群，发现在门水平上以变形菌门（Proteobacteria）、Acidobacteriota 门 和 拟 杆 菌 门（Bacteroidota）为优势菌群，在纲水平上以变形杆菌纲（Gammaproteobacteria）、拟杆菌纲（Bacteroidia）和Vicinamibacteria 纲为优势菌群，这与以往的研究基本一致［20-21］。另外，吕桌呈等［21］研究表明绿肥处理，可以使土壤中变形菌门相对丰度提高；李文广等［20］报导饲料油菜翻压还田土壤疣微菌门和变形菌门相对丰度提高。本研究油菜压青后土壤中疣微菌门（Verrucomicrobiota）和变形菌门（Proteobacteria）相对丰度也均有一定程度的提高，这与前人研究结果相一致。我们对油菜压青后门水平细菌功能进行了分析，发现好氧型细菌丰度升高，厌氧型细菌丰度降低，这可能是因为油菜压青改善了土壤结构，增强了土壤透气性，促进了好氧型细菌的增长；另外，压青后致病性细菌丰度的降低，有利于降低植物细菌性病害。

作为土壤结构的基本单元，土壤团聚体对土壤肥力、土壤通气性、土壤微生物、作物产量以及土壤的可持续利用有重要影响。较多研究表明绿肥压青有利于土壤团聚体结构的改善：袁苗苗等［9］研究表明油菜压青可以提高土壤大团聚体含量和团聚体对土壤有机质的贡献率，有利于土壤团聚体稳定性；张钦等［22］研究表明连续种植绿肥提高了土壤大团聚体的含量和土壤团聚体平均质量直径。本研究中油菜压青后复种棉花，发现大团聚体质量百分含量显著提高，微团聚体质量百分含量降低，且土壤团聚体平均质量直径显著提高，这与之前的研究相一致。这说明绿肥油菜与棉花的复种模式改变了土壤团聚体粒级分布，促进土壤微团聚体向大团聚体的转化，提高了土壤团聚体平均质量直径。土壤团聚体平均质量直径值越大，表明土壤团聚体的团聚度越高，团聚体的稳定性越好［23-24］，而土壤团聚体稳定性的提高可以减少土壤养分流失，增强土壤结构的稳定性和抗侵蚀性［22］。

本研究通过翻压绿肥油菜，同时提高土壤细菌物种多样性和土壤团聚体结构稳定性。已有研究表明土壤微生物与土壤团聚体有明显相关性：李景等［25］研究表明土壤细菌香农指数与土壤团聚体平均质量直径显著相关；蒋雪洋等［26］研究发现土壤团聚体平均质量直径与土壤真菌和丛枝菌根真菌丰度极显著正相关，与古细菌丰度显著正相关。土壤团聚体是土壤微生物生存活动的场所，土壤微生物是土壤团聚体形成的重要影响因素［26-27］，土壤微生物与土壤团聚体相互作用，相互影响。土壤大团聚体和超大团聚体含量提高，改善了土壤结构，增加了土壤通气性，改善了土壤微生态环境，有利于土壤微生物活动繁衍；土壤微生物代谢产物、生物量碳和微生物菌丝促进土壤大团聚体形成［28］。

4 结论

本试验分析了绿肥油菜压青对土壤细菌菌群组成和土壤团聚体结构的影响。结果发现，油菜压青显著提高了土壤中细菌菌群的多样性，在不同分类水平上改变了优势菌群的相对丰度分布，降低了厌氧性和致病性表型菌群相对丰度，改善了土壤细菌微生物环境；另外，绿肥油菜压青促进了土壤微团聚体向大团聚体的转化，提高了土壤团聚体平均质量直径，改善了土壤团聚体结构的稳定性。