牛羊肉中3种抗结核药物的多残留检测方法的建立

魏佩玲，胡 波，张蓉银，陆向梅，宫 平

（新疆畜牧科学院畜牧业质量标准研究所，新疆乌鲁木齐 830000）

结核病菌除感染人外，还感染牛羊等哺乳动物。人结核有10%以上是由牛、羊结核分枝杆菌引起的，牛羊在新疆的结核发病率超过2%，且长期未受到关注（郭志文和武帅，2021；郭保民和刘红葵，2012；杨醉宇等，2009；努尔扎提，2006）。为保障食品安全，避免牛、羊肉体内药物残留，需加强对牛、羊肉食品的安全监控，建立相应的残留检测方法（李国华，2017；陈古丽，2014）。因此，本项目针对这一情况，建立牛、羊肉中抗结核类药物的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。

目前，针对牛羊肉的前处理方法主要有快速溶剂萃取、固相萃取、液-液萃取、基质固相分散技术等（吴会仙，2021；张晓燕，2021；乔丽娟，2020）。本实验室选用固相萃取方法，此技术具有高效性和准确性高等优点（雷攀明，2021）。近年来，由于QuEChERS具有操作简单、快速、准确度高的特点，被广泛应用到农兽药残留检测中（吕佳乐等，2020）。因此，本项目在建立检测方法的过程中，在前处理部分（净化条件的选择）采用两种前处理方式，对比优缺点，对本单位的检测能力、检测范围、检测速度的提升具有重要意义。

1 材料与仪器

1.1 试验材料 试验所用羊肉、牛肉样品购于农贸市场。本实验所用试剂除特别注明者外均为分析纯。乙腈为色谱纯、甲酸为优级纯。标准品：利福平、利福喷丁、利福布汀标准品纯度均大于98%。

1.2 主要仪器设备 超高效液相色谱-质谱 联 用 仪（I CLASS/XEVO TQD）、电 子 天 平（0.0001g）、高速冷冻离心机、水浴氮吹仪、固相萃取仪、数控超声清洗器、涡旋混合仪。

2 试验方法

2.1 样品处理

2.1.1 样品的制备 将牛肉、羊肉切块，分别用绞肉机处理后分装后于-20℃保存备用。

2.1.2 样品处理 称取5.0 g均质后的样品置于50.0 mL具塞离心管中，用15.0 mL 1.0%冰乙酸溶液振荡混匀，再加入15.0 mL乙腈，振荡10 min。

混匀后加入QuEChERS提取包，振荡混匀后10000 r/min，0～ 4℃离心 5 min，取 9.0 mL 上清液加入QuEChERS净化管中，振荡混匀后10000 r/min，0～4℃离心5 min，取5.0 mL上清液置于40℃下氮吹至0.4 mL，再加入1.0 mL乙腈溶解，过0.22μm滤膜后上机测定。

2.2 液相色谱条件 色谱柱：C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；柱温：30℃ ；流速：0.3 mL/min；进样量：10μL；梯度洗脱方式见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.3 质谱条件 检测方式：多反应监测（MRM）模式；

电离模式：ESI+；

毛细管电压：2.50 kV；

锥孔电压：45 V；

源温度：150℃；

脱溶剂气温度：500℃；

脱溶剂气流量：650 L/Hr

其他质谱参数见表2。

表2 主要质谱参数

3 结果与分析

3.1 液相条件的优化

3.1.1 色谱柱的选择 本研究采用Waters ACQUITY UPLC® C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）来进行分离。3种抗结核药物在C18柱上的分离情况根据色谱峰可以看出，3种化合物均可以出峰且能达到有效分离，利福布汀、利福平、利福喷汀保留时间分别为4.29、4.50、4.68 min。

3.1.2 流动相的选择 试验发现，当水相为水，利福喷汀、利福布汀难以出峰，且目标物的响应值都很低；当选择0.2%甲酸水溶液为水相，甲醇为有机相时，利福喷汀、利福布汀会出现峰形叠加的情况；0.2%甲酸水溶液为水相，乙腈为有机相时，4种化合物的分离效果较好，峰形尖锐，与甲醇相比，乙腈的黏度更小，传质阻抗小，更能溶解、洗脱目标化合物。综上所述，以0.2%甲酸水溶液为水相、乙腈为有机相构成流动相体系，采用梯度洗脱方式可以使3种化合物取得较好的分离度。

3.2 质谱条件的优化 配制浓度为200 ng/mL的3种抗结核药物混合标准溶液，用蠕动泵自动将混合标准溶液推入到ESI离子源中，首先进行全扫描，分别找出3个化合物的分子离子峰[M+H]+，然后对母离子逐级施加碰撞能量，使目标化合物破裂以获得二级碎片离子，得到丰度较强的两个子离子，分别作为定量和定性离子。继续优化每一个目标物的MS/MS参数，最终得到优化后的母离子、子离子、碰撞能量等参数，3种抗结核药物母离子的质量数分别为823.12、877.16、847.15。根据响应值判断定量和定性离子，在实际样品检测中将二级离子的碎片信息与标准溶液进行比较，可以较好地找出目标化合物，避免假阳性情况的发生。

3.3 提取条件的选择 试验发现，3种抗结核药物的提取回收率在酸性条件下明显高于碱性和中性条件下。因此，选取实验室常用的甲酸、乙酸，进一步研究酸的种类及浓度对3种抗结核药物回收率的影响。试验发现，添加甲酸后对回收率的提高略高于乙酸。结果表明，当甲酸浓度为0.1%时，3种抗结核药物的回收率为60.8%～119.6%；当甲酸浓度为0.5%时，3种抗结核药物的回收率为15.3%～82.2%。根据化合物的性质，试验选用了不同提取溶剂对3种抗结核药物进行提取。试验结果如表3所示，当用乙酸乙酯和正己烷提取时，利福平的回收率不足50%；当用乙腈提取时，3种化合物的提取回收率为60.8%～119.6%，当用甲醇提取时，3种化合物的提取回收率为26.1%～81.5%。

表3 不同提取溶剂对3种抗结核药物提取效果的影响 %

根据上述试验结果确定用0.1%甲酸，乙腈为本试验的提取液。

3.4 净化条件的选择

3.4.1 固相萃取小柱的选择 根据化合物的性质，试验比较了Oasis HLB、Oasis PRiME HLB固相萃取柱及QuEChERS法对利福平、利福喷汀和利福布汀的保留情况。3种固相萃取柱的比较结果见图1，由图1可见，经HLB萃取柱处理后，3种化合物回收率较其他两种萃取柱低，波动范围大，利福喷汀最为明显；经PRiME HLB萃取柱处理后，利福平回收率较其他两种萃取柱波动范围大，稳定性较差，利福喷汀回收率偏低；经QuEChERS法处理后，3种化合物回收率相比较其他两种萃取柱相对稳定，净化效果较好。最终，本试验的固相萃取柱确定为QuEChERS法。

图1 3种固相萃取柱的比较

3.4.2 洗脱体积的优化 为优化洗脱溶液，试验分别比较了乙腈、甲酸-甲醇、乙酸-甲醇作为洗脱溶液时3种抗结核药物的过柱回收率。结果发现，在洗脱溶液中添加少量乙酸更有利于3种化合物的洗脱，进一步对乙酸浓度进行比较后，试验最终确定洗脱溶液为甲醇（含0.5%乙酸）。依次用0.1%甲酸水溶液、水和50%甲醇水溶液对PRiMEHLB和HLB柱进行淋洗，研究甲醇（含0.5%乙酸）的体积对3种抗结核药物的洗脱情况。试验结果可以看出，甲醇（含0.5%乙酸）的洗脱体积为3.0 mL时，3种抗结核药物基本全部洗脱，为确保3种抗结核药物能全部洗脱，试验最终确定洗脱体积为4.0 mL。

3.5 方法学验证

3.5.1 标准曲线、检出限和定量限 配制基质匹配曲线在本章建立的仪器条件下进行测定，用峰面积（y）分别对3种抗结核药物的质量浓度（x）作回归分析，如表4所示，利福平、利福喷汀和利福布汀分别在0.1～20.0μg/L范围内呈良好线性，相关系数均大于0.99；以3倍和10倍信噪比分别为3种抗结核药物的检出限和定量限，利福平、利福喷丁和利福布汀的检出限和定量限分别为0.30、0.31、0.22μg/kg 和 1.02、1.03、0.73μg/kg。

表4 3种抗结核药物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

3.5.2 准确度和精密度 为验证方法的准确度与精密度，试验以空白牛肉、羊肉样品为基质，通过添加低、中、高3个不同水平的混合标准溶液进行添加回收试验，每个水平做6组平行，按1.3节进行样品前处理后上机测定，结果见表5。

表5 不同基质中3 种抗结核药物的加标回收率和相对标准偏差

3种目标化合物利福平、利福喷丁、利福布汀在牛肉的平均回收率分别为62.8%～109.2%、61.1%～115.4%、66.3%～105.9%，相对标准偏差（RSD，n=6）分别为4.0%～16.3%，4.3%%～14.3%，4.6%～10.0%，方法的精密度与准确度满足相关标准要求。

3种目标化合物利福平、利福喷丁、利福布汀在羊肉的平均回收率分别介于62.1%～94.2%、61.6%～114.6%、61.2%～108.5%，相对标准偏差（RSD，n=6）分别为 9.2% ～ 15.8%，11.2% ～18.9%，3.0%～11.3%，方法的精密度与准确度满足相关标准要求。

3.6 实际样品的测定 购买新疆当地超市、农贸市场的羊肉、牛肉等畜产品共40份，待测样品和质控样品均按上述方法同时进行检测。在实际样品中，3种抗结核药物均未检出，但质控样品中3种抗结核药物的回收率良好，且保留时间与标准溶液的保留时间保持一致，说明该方法可用于实际样品中3种抗结核药物的残留检测。

4 结论

本研究主要以牛肉、羊肉为研究对象，建立超高效液相色谱-串联质谱检测方法用于检测3种抗结核药物残留。该方法具有操作容易、再现性好、灵敏度和选择性高等优点。准确度和精密度满足国标GB/T 27404-2008中对回收率和精密度的要求，说明该方法可用于动物组织中3种抗结核药物的残留检测，可满足相关食品部门和企业对牛羊肉中抗结核类药物残留的检测，为严格质量提供必要的技术支持。