双参芎连颗粒对动脉粥样硬化大鼠腹主动脉斑块的影响

李然，谢朋呈，辛高杰，李磊，任建勋，刘建勋，付建华，2

1.中国中医科学院西苑医院基础医学研究所，北京 100091；2.国家中医心血管疾病临床医学研究中心，北京100091

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是动脉硬化血管病中最重要的一种，其病变特点主要是由内膜开始出现复合糖类积聚和纤维组织增生，并伴有继发性病变及斑块破裂等。斑块的不稳定性可导致急性心肌梗死。双参芎连颗粒是本课题组根据AS病机特点拟定的方剂，具有益气活血、化痰解毒功效。前期研究发现，双参芎连颗粒可调节AS大鼠脂质代谢，减轻炎症反应，抑制细胞凋亡。本实验采用高脂饲料喂养联合腹主动脉拉伤法制备AS大鼠模型，进一步观察双参芎连颗粒对大鼠腹主动脉粥样硬化斑块的影响，明确其改善AS的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

健康SPF级SD大鼠202只，雄性，体质量（230±10）g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于中国中医科学院西苑医院SPF级实验动物中心，温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%，12 h光暗循环，自由摄食饮水。髙脂饲料，北京科澳协力饲料有限公司，含78.35%普通饲料、2% L-蛋氨酸、2%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.15%丙硫氧嘧啶、7%猪油、5%蛋黄粉和5%全脂奶粉。

1.2 药物

双参芎连颗粒（人参、川芎、黄连、泽泻等），由中国中医科学院西苑医院基础医学研究所提供，批号20111012，1 g颗粒相当于原药材2.44 g，用蒸馏水配制成浓度分别为0.08、0.16、0.32 g/mL。丹蒌片，吉林康奈尔药业有限责任公司，0.3 g/片，批号20110702，实验时用蒸馏水配制成0.08 g/mL溶液。舒降之片，杭州默沙东制药有限公司，20 mg/片，批号110594，用蒸馏水配制成浓度为0.4 mg/mL。

1.3 主要试剂与仪器

同型半胱氨酸（Hcy）对照品，美国Sigma公司，批号037K3798，纯度＞95%；辛烷基磺酸钠，美国Thermo Fisher Scientific公司，批号0 800739；磷酸氢二铵，分析纯，天津光复精细化工研究所，批号20 190512；甲醇，分析纯，美国Thermo Fisher，批号 095586；乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na），美国Sigma，批号 950511；二硫苏糖醇，美国Sigma，批号 925512；PBS，北京索莱宝科技有限公司，批号20 190425；基质金属蛋白酶2（MMP-2）抗体、核因子（NF）-κB p65抗体、p-NF-κB p65抗体，美国Proteintech公司，批号分 别 为10373-2-AP、CL488-54535、10625-1-AP；2.0F 动脉取血栓导管，美国Fogarty 公司，批号58867347。MIKRO-22R 高速台式冷冻离心机，德国Hettich 公司；BX-41 光学显微镜，日本OLYMPUS；VE186型电泳槽，美国Bio-Rad公司；MPIAS-500型多媒体彩色病理图文分析系统，北京正恒博诚科技发展有限公司；16通道Coularray库伦阵列式电化学高效液相色谱仪、5600A电化学检测器、582液相泵，美国ESA公司。

1.4 造模、分组及给药

186只大鼠适应性饲养7 d后随机选取36只作为空白组，予普通饲料喂养，其余大鼠予高脂饲料喂养，连续4周。第4周从空白组和高脂饲料喂养大鼠中随机抽取10只心脏取血，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，分离血清，测定血清总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量。确定大鼠TC、LDL-C含量明显升高后，将高脂饲料喂养的大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，沿颈前正中线无菌切开皮肤，暴露颈前三角区左侧颈总动脉，结扎远心端，微动脉夹阻断近心端，用眼科剪剪一“V”形切口，插入2.0F动脉取血栓导管（预先用肝素钠生理盐水浸润），插入深度15 cm。向球囊内打气使其充分扩张至有阻力感，匀速回拉球囊8～10 cm，重复上述操作5次。操作完成后回抽球囊内气体，撤出球囊导管，结扎左侧颈总动脉近心端，无菌缝合切口，局部予青霉素生理盐水消毒。

将手术大鼠随机分为模型组、丹蒌片组、舒降之组和双参芎连颗粒低、中、高剂量组，每组26只。术后3 d开始给药，丹蒌片组予丹蒌片溶液0.8 g/kg灌胃，舒降之组予舒降之溶液4 mg/kg灌胃，双参芎连颗粒低、中、高剂量组予不同浓度双参芎连颗粒溶液灌胃，给药剂量分别为0.8、1.6、3.2 g/kg（按颗粒计），灌胃体积1 mL/100 g，每日1次，连续8周，空白组和模型组予等体积蒸馏水灌胃。除空白组外，给药期间其余各组大鼠继续高脂饲料喂养。

1.5 取材

给药第2、4、6、8周分批腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血1 mL，加入100 μL EDTA-2Na抗凝，20 ℃、2 500 r/min离心25 min，分离大鼠血浆，冻存备用。分离腹主动脉，一部分置于-80 ℃冰箱冻存，用于Western blot检测，另一部分置于10%中性福尔马林固定，用于HE染色及免疫组化分析。

1.6 HE染色

取出固定后的腹主动脉组织，选取6段不同位置腹主动脉（每段约5 mm），石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下观察，应用显微数码图像拍摄系统拍摄腹主动脉粥样硬化斑块面积最大处，计算校正斑块面积和管腔狭窄率。校正斑块面积（%）＝斑块面积÷斑块部位外弹性膜内面积×100%，管腔狭窄率（%）＝斑块面积÷斑块部位内弹性膜内面积×100%。

1.7 血浆同型半胱氨酸含量测定

取200 μL血浆加入新鲜配制的0.05 mol/L二硫苏糖醇溶液50 μL，室温放置还原20 min，加入0.3 mol/L高氯酸800 μL沉淀蛋白，4 ℃、15 000 r/min离心20 min，取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得大鼠血浆样品。

色谱条件：采用Waters-Spherisorb ODS2 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为10 mmol/L磷酸氢二铵-12 mmol/L辛烷基磺酸钠-10%甲醇（pH 2.33±0.01），流速1 mL/min，电势＋450 mV、＋800 mV，柱温30 ℃，进样量10 μL。

1.8 免疫组化染色

腹主动脉组织石蜡切片于75 ℃烘箱中烤片85 min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ分别浸泡30 min脱蜡；100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ各浸泡10 min，95%乙醇、85%乙醇、80%乙醇浸泡5 min 水化；蒸馏水洗3 次，每次2 min，PBS洗3次，每次5 min；高压锅煮沸枸橼酸钠溶液，高压120 s进行抗原修复；滴加MMP-2一抗（1∶100），4 ℃冰箱过夜；次日室温恢复30 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加二抗，室温孵育45 min；PBS清洗，DAB显色，蒸馏水冲洗2次；80%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ浸泡10 min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡10 min脱水透明，中性树脂封片；显微镜下观察，阳性表达为棕色颗粒，计算斑块位置阳性表达的平均光密度。

1.9 Western blot检测

用PBS缓冲液裂解腹主动脉组织提取总蛋白，以牛血清白蛋白作为标准品，按蛋白定量试剂盒说明书绘制标准曲线，紫外分光光度计波长562 nm处测定光密度，计算蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转至硝酸纤维素膜上，牛血清白蛋白室温封闭30 min，加入NF-κB p65和p-NF-κB p65多克隆抗体（1∶2 000），4 ℃孵育过夜。加入HRP标记二抗（1∶2 000），室温孵育1 h。化学发光法显影，用图像分析系统测定蛋白灰度值，以GAPDH为内参，计算蛋白相对表达量。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 双参芎连颗粒对模型大鼠校正斑块面积和管腔狭窄率的影响

与空白组同一时点比较，模型组大鼠腹主动脉组织校正斑块面积增加、管腔狭窄率显著升高（＜0.01）；与模型组同一时点比较，双参芎连颗粒高剂量组、丹蒌片组和舒降之组大鼠给药第6、8周腹主动脉组织校正斑块面积减少、管腔狭窄率降低（＜0.05，＜0.01）。见图1、表1、表2。

表1 各组大鼠不同时点校正斑块面积比较（，%）

表2 各组大鼠不同时点管腔狭窄率比较（，%）

图1 各组大鼠腹主动脉组织形态（HE染色，×40）

2.2 双参芎连颗粒对模型大鼠血浆同型半胱氨酸含量的影响

与空白组同一时点比较，模型组大鼠各时点血浆Hcy含量显著增加（＜0.05，＜0.01）；与模型组同一时点比较，各给药组大鼠第6、8周血浆Hcy含量显著减少（＜0.05，＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠不同时点血浆Hcy含量比较（，μmol/L）

2.3 双参芎连颗粒对模型大鼠腹主动脉组织基质金属蛋白酶-2表达的影响

与空白组比较，模型组第8周大鼠腹主动脉组织MMP-2表达显著升高（＜0.01）；与模型组比较，各给药组第8周大鼠腹主动脉组织MMP-2表达显著降低（＜0.01）。见表4、图2。

图2 各组大鼠腹主动脉组织MMP-2阳性表达（免疫组化染色，×200）

表4 各组大鼠腹主动脉组织MMP-2表达比较（）

2.4 双参芎连颗粒对模型大鼠腹主动脉组织核转录因子-κB p65表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠第8周腹主动脉组织p-NF-κB p65/NF-κB p65比值升高，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠第8 周腹主动脉组织p-NF-κB p65/NF-κB p65比值降低，差异有统计学意义（＜0.01）。见图3、表5。

图3 各组大鼠腹主动脉组织NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白免疫印迹

表5 各组大鼠腹主动脉组织p-NF-κB p65/NF-κB p65比值比较（）

3 讨论

AS是急性冠状动脉综合征及脑卒中的主要病理机制，尤其斑块的稳定性被认为是影响AS重大心血管不良事件的关键因素。动脉硬化斑块分为稳定斑块和不稳定斑块，不稳定斑块即易损斑块，具有血栓形成倾向。易损斑块的主要特点包括脂质核心增大伴纤维帽变薄、炎症标志物（单核/巨噬细胞聚集，伴或不伴T淋巴细胞浸润）、斑块撕裂、内皮细胞脱落伴表层血小板聚集等，其他少见特点如斑块浅表处钙化结节、斑块内出血、斑块所在血管正性扩张等。本实验结果显示，随着给药时间延长，各给药组大鼠校正斑块面积减少、管腔狭窄率不同程度降低，其中以丹蒌片组、舒降之组和双参芎连颗粒高剂量组作用明显。

有研究显示，体内Hcy含量增加可加速AS发展，促进斑块破裂形成血栓，引起心脑血管疾病。血浆Hcy含量增加与Hcy代谢酶异常及参与Hcy代谢维生素缺乏等有关。研究表明，高Hcy血症导致AS的主要机制是通过在代谢过程中发生自身氧化，进而损害血管内皮细胞结构和功能，导致内皮细胞凋亡。Hcy也是一种炎症因子，可加速血管弹性纤维溶解，促进胶原纤维合成及平滑肌细胞增殖，进而加速AS发生发展。Hcy主要为蛋氨酸脱甲基后生成的代谢产物，本实验所用高脂饲料中加入蛋氨酸，造成大鼠高Hcy血症，各时点模型组大鼠血浆Hcy含量均高于空白组，而给药后血浆Hcy含量有不同程度降低。

AS发病早期，高脂血症引起血管内皮细胞功能改变，使内皮细胞活化，中性粒细胞、淋巴细胞及单核巨噬细胞黏附并释放多种细胞因子，如白细胞介素-1、血小板衍生生长因子等，从而产生MMP。纤维斑块时期，血管组织抗损伤作用启动，中性粒细胞和巨噬细胞同时释放MMP及金属蛋白酶组织抑制因子，限制MMP降解，纤维斑块中MMP活性持续增强，降解胶原纤维，使纤维帽变薄，斑块不稳定性增加。MMP-2可特异性分解多种细胞外基质，包括弹性蛋白、层黏连蛋白等，其对AS斑块的影响主要有通过降解包绕在中层平滑肌细胞外的基质，促进血管中层平滑肌细胞向内膜迁移，从而分泌更多细胞外基质；降解细胞外基质使纤维帽变薄，减弱抵抗应力作用，使AS斑块易发生破裂；破坏细胞与基质之间的相互作用，促进血管平滑肌细胞释放肿瘤坏死因子，从而加速AS 发展。本实验结果显示，MMP-2在AS斑块的内皮细胞和平滑肌细胞中大量表达，并在间质中沉积，尤其斑块肩部、纤维帽部表达密集，双参芎连颗粒能有效降低AS斑块中MMP-2表达。

炎性反应是引起斑块易损的主要驱动力，而调节炎症最重要的转录因子是NF-κB。NF-κB活化并转移至核内，启动促炎因子转录和表达，促进炎症因子大量释放。炎症因子可以引起巨噬细胞分化和浸润、平滑肌细胞迁移和增殖、MMP-2/9表达升高。本实验结果显示，双参芎连颗粒可降低模型大鼠腹主动脉组织p-NF-κB p65/NF-κB p65比值，抑制NF-κB p65磷酸化后激活的一系列炎症反应。

综上，双参芎连颗粒可降低AS大鼠腹主动脉斑块面积和管腔狭窄率，通过降低血浆Hcy含量、斑块组织MMP-2表达及NF-κB p65磷酸化水平稳定AS斑块。