槐定碱对白色念珠菌生物被膜形成的影响

何秋映，曾红

（塔里木大学生命科学与技术学院/塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

由于抗菌药物的滥用，细菌耐药性问题［1］日趋严重，甚至出现“超级细菌”，致病真菌更是产生了极强的耐药性，而生物被膜（bacterial biofilm，BF）的形成有利于致病真菌有效躲避免疫系统，增加自身耐药性。BF是指微生物附着于生物材料或人体组织表面，由自身产生的大量包裹细菌水合性基质所组成的结构性细菌群落［1］。在食品方面，BF常为食源性致病菌提供生存保护［2］，从而导致食品污染，如果人食用食源性致病菌污染的食品会引发食物中毒甚至威胁生命，此外食源性致病菌形成的BF也会加大食品消毒难度［3］。在医疗方面BF的形成会增加革兰氏阴性杆菌、革兰氏阳性球菌、表皮葡萄球菌、念珠菌、肠球菌、绿脓杆菌等病原菌对抗生素的耐药性，并且会随着医疗器械转移，使临床病原菌感染的疾病治疗难度增加［4-5］。

白色念珠菌（Candida albicans）对宿主表面的黏附能力是决定BF能否形成的前提，如果形成的BF越多，其致病力越强［6-7］。白色念珠菌BF是由酵母相的孢子、菌丝及假菌丝构成的三维立体结构［8-10］，该结构增强了白色念珠菌的适应能力、抵挡抗真菌药物作用的能力以及躲避宿主免疫杀伤的能力［11］。此外，白色念珠菌BF能不断脱落并释放真菌细胞，使其菌体可以迁移至机体其他部位，导致宿主反复发生感染，大大增加治愈真菌感染的难度［12］。

植物是各种生物活性分子的重要来源，使用植物分子对抗多重耐药菌株以及白色念珠菌的BF生长是一种极具前景的策略［13］。目前植物来源的醌类［14］、萜类［15］、黄酮类［16］、生物碱类［17-18］以及苯丙素类［19］等化合物显示出较好的抗白色念珠菌BF活性。槐定碱（Sophoridine）是从豆科槐属植物苦豆子中提取的单体生物碱，具有抗病毒、抗肿瘤、抗心律失常、抗炎抑菌及免疫抑制等广泛药理活性［20-21］，其可以轻度抑制肿瘤细胞的DNA合成，使细胞增殖阻断在G2期，并且槐定碱对DNA拓扑异构酶Ⅰ有抑制作用［22］，但目前关于槐定碱对BF抑制活性的相关研究报道较少。本试验研究槐定碱对白色念珠菌BF形成的抑制作用，通过检测槐定碱对白色念珠菌的MIC值、形态特征、胞外蛋白酶、磷脂酶活性以及胞外DNA的影响，探讨槐定碱对白色念珠菌BF形成的影响，为研发抑制白色念珠菌药物提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌株：白色念珠菌（Candida albicans）ATCC64550，购于美国典型培养物保藏中心。

药品：槐定碱，纯度：99.4%，CAS号：6882-68-4；两性霉素B，纯度：USP级，750 mg/g，CAS号：1397-89-3；蛋白酶K，纯度：30 U/mg，CAS号：39450-01-6；以上药品均购自中国上海源叶生物科技有限公司。

培养基：沙氏琼脂培养基（SDA），4%葡萄糖，1%蛋白胨，2%琼脂粉；沙氏液体培养基（SDB），4%葡萄糖，1%蛋白胨；牛奶培养基，10%脱脂奶粉，1%琼脂。

主要试剂：氯仿、丙酮、无水乙醇等有机试剂均为分析纯，购自天津市北联精细化学品开发有限公司；Lyticase溶壁酶，购自美国Sigma试剂公司。

仪器：万分之一电子分析天平（ML204/02，奥豪斯仪器有限公司）；紫外分光光度计（Evolution 201，赛默飞世尔科技公司）；凝胶成像分析系统（Chem-Doc XRS+，伯乐生命医学产品有限公司）；光学显微镜（BH-2，奥林巴斯有限公司）；扫描电子显微镜（Apreo S，赛默飞世尔科技公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 微量稀释法检测槐定碱最小抑菌浓度

最小抑菌浓度（MIC）板制备：参照WAYNE P［23］研究方法并稍作改进，将浓度为1×108CFU/mL的白色念珠菌菌液重新悬浮并稀释至1×106CFU/mL。先在96孔板A1～C8孔中加入100 μL的SDB培养基，再吸取100 μL浓度为512 mg/mL的槐定碱溶液加入A1～C1孔中，与100 μL的SDB培养基混匀，分别吸取100 μL混匀后的溶液加入到A2～C2孔中再混匀，依次类推，最后弃去A8～C8孔中的100 μL混合溶液，得到不同浓度（256 mg/mL、128 mg/mL、64 mg/mL、32 mg/mL、16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL）的槐定碱溶液［24］，将100 μL浓度为 1×106CFU/mL的菌液加入到已经混合好的槐定碱溶液所在的96孔板中，使得槐定碱溶液再次被稀释，终浓度为128 mg/mL、64 mg/mL、32 mg/mL、16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL。另外将A10～C10孔设置为阴性对照组（SDB培养液 100 μL+菌液100 μL）、A12～C12孔设置为空白对照组（SDB培养液200 μL）。按照同样的方法用两性霉素B做阳性对照组，由于两性霉素B抑菌效果显著，因此设置其终浓度分别为64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL。上述试验每个浓度均设3次重复。将96孔板置于37℃恒温培养箱中培养48 h后观察结果。

MIC值判定：孔内完全抑制菌株生长的最低药物浓度为MIC值，且仅当空白对照组内菌株没有生长以及阴性对照组内菌株正常生长时，数据有效。

1.2.2 光学显微镜下观察槐定碱对白色念珠菌BF的抑制作用

采用细胞爬片法［25］观察白色念珠菌BF结构。槐定碱终浓度分别为16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL，另外做两组阴性对照，并在6孔板孔底放置无菌盖玻片。37℃静置培养72 h后取出盖玻片，蒸馏水冲洗3次去除浮游细胞，置于光学显微镜下观察白色念珠菌BF结构。

1.2.3 扫描电子显微镜下观察槐定碱对白色念珠菌BF的抑制作用

前期处理及槐定碱终浓度参照1.2.2，24 h后取出6孔板，在无菌PBS缓冲溶液中清洗3次。用0.1 mol/L二甲基乙酸钠缓冲液（pH 7.3）配制2.5%戊二醛溶液后，于4℃条件下固定6孔板中的盖玻片12 h，经无菌PBS缓冲溶液漂洗3次后依次使用30%、50%、70%、85%、95%、100%的乙醇溶液进行梯度脱水15 min，随即对样品进行临界点干燥、喷金，使用扫描电子显微镜观察白色念珠菌［26］。

1.2.4 不同时期槐定碱对白色念珠菌BF形成的抑制率检测

采用微量稀释法检测不同时期槐定碱对白色念珠菌BF形成的抑制率。将100 μL菌液（1×106CFU/mL）加入96孔板中，37℃恒温培养。当白色念珠菌BF培养0 h、4 h、8 h、12 h、24 h 时，在孔板的第1～4行分别加入100 μL浓度为64 mg/mL、32 mg/mL、16 mg/mL、8 mg/mL的槐定碱溶液，使得槐定碱终浓度为32 mg/mL、16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL，第5列也在同样的时间点加入100 μL的SDB培养基作为阴性对照组，继续培养24 h。每孔设置3次重复。用酶标仪在490 nm下检测各孔的OD值，根据公式利用GraphPad Prism 7.0软件计算BF抑制率，BF抑制率=（1-OD处理组/OD阴性对照组）×100%。

1.2.5 槐定碱对白色念珠菌胞外蛋白酶的影响

采用牛乳平板法［25］测定胞外蛋白酶活性。用无菌打孔器在凝固的牛奶培养基上打出6个小孔，按1.2.1的微量稀释法收集浓度为16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL的槐定碱处理过的菌液以及阴性对照组的菌液，离心得到上清；将离心后的上清、蛋白酶K（20 μg/mL）、无菌PBS缓冲溶液各20 μL加入孔中，蛋白酶K（20 μg/mL）、无菌PBS缓冲溶液分别作为阳性对照组和空白对照组，于37℃培养箱中静置培养6 h。用游标卡尺测量孔周围因蛋白质降解形成的透明水解圈直径。

1.2.6 槐定碱对白色念珠菌磷脂酶的影响

采用卵黄平板法［27］测定磷脂酶活性。在96孔板A1～C12孔中加入 100 μL SDB 培养基，分别在 A1～A3、A4～A6、A7～A9孔加入 100 μL 64 mg/mL、32 mg/mL、16 mg/mL的槐定碱溶液，随后将其按列依次稀释，弃去C1～C9孔的100 μL混合溶液，最后在96孔板A1～C12孔中加入100 μL菌液（1×106CFU/mL）与槐定碱溶液混合，使槐定碱终浓度分别为16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL，A10～C12孔为阴性对照组，37℃恒温箱内培养12 h。用微量移液器分别取10由16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL槐定碱溶液处理后的菌液滴在蛋黄琼脂培养基中间，使形状呈圆形。将蛋黄琼脂培养基置于37℃恒温箱中培养72 h，若白色念珠菌分泌胞外磷脂酶，则菌落周围会出现一圈白色沉淀。使用游标卡尺测量各组的白色念珠菌菌落直径和白色沉淀圈直径，并计算菌落直径和沉淀圈直径的比值［28-29］，即沉淀圈值（precipitation zone，PZ）。

1.2.7 槐定碱对白色念珠菌胞外DNA的影响

采用SDS法［25］提取白色念珠菌基因组总DNA含量。

1.3 统计分析

2 结果分析

2.1 槐定碱对白色念珠菌MIC值的测定结果

如图1a所示，从右至左依次观察可知，阴性对照组的白色念珠菌生长状况良好，而空白对照组的SDB培养基内无白色念珠菌的生长。在浓度为8～128 mg/mL的槐定碱作用下，白色念珠菌几乎不能生长。在1～4 mg/mL的槐定碱作用下，白色念珠菌可以正常生长。如图1b所示，从右至左依次观察可知，两性霉素B的浓度为2～64 μg/mL时未见白色念珠菌生长，而两性霉素B浓度为0.5～1 μg/mL时有白色念珠菌生长。因此，判定槐定碱对白色念珠菌的MIC值为8 mg/mL。

图1 不同浓度槐定碱对白色念珠菌MIC值的测定

2.2 光学显微镜下观察槐定碱对白色念珠菌BF生长的影响

通过光学显微镜观察发现，阴性对照组可见大量两相细胞（即酵母相细胞和菌丝相细胞)共存，两相细胞彼此依附，相互粘连，形成了大片结构稳定、彼此交错的网格区域，并且存在浓度依赖关系（图2a）。当槐定碱浓度为4 mg/mL时，在光学显微镜下的细胞类型主要为酵母相细胞及少量短小的菌丝相细胞，短小的菌丝相细胞彼此粘连，形成较小的芽管结构（图2b）。当槐定碱浓度为8 mg/mL时，在光学显微镜下观察到少数粘连的酵母相细胞，未见菌丝相细胞，酵母相细胞彼此粘连（图2c）。当槐定碱浓度为16 mg/mL时，在光学显微镜下发现有少量的酵母相细胞存在，粘连情况发生较少，槐定碱对白色念珠菌BF的影响明显（图2d）。

图2 光学显微镜下观察槐定碱对白色念珠菌BF生长的影响

2.3 扫描电子显微镜下观察槐定碱对白色念珠菌BF生长的影响

由扫描电子显微镜结果观察可知，阴性对照组（图3a，图3e）可见白色念珠菌形成明显的BF，两相细胞同时存在；与阴性对照相比，槐定碱的浓度为4 mg/mL时，仍存在BF，可观察到两相细胞，酵母相细胞发生细胞凹陷（图3b，图3f）；当槐定碱浓度为8 mg/mL时，有BF形成情况，细胞也发生凹陷（图3c，图3g）；当槐定碱浓度为16 mg/mL时，白色念珠菌难以发现BF，细胞发生明显凹陷（图3d，图3h）；因此，推测槐定碱对白色念珠菌BF的形成具有一定的抑制作用。

图3 扫描电子显微镜下观察槐定碱对白色念珠菌BF生长的影响

2.4 不同时期槐定碱对白色念珠菌BF形成的抑制率

如表1所示，在白色念珠菌BF形成的初期（0～4 h），浓度≥8 mg/mL的槐定碱对白色念珠菌BF的生长均有明显的抑制作用，抑制率均在80%以上。在BF生长最快的时期（4～12 h）内，浓度≥16 mg/mL的槐定碱能干预白色念珠菌BF的形成。在BF趋于成熟时（12 h）再加入槐定碱处理，发现仅有高浓度（≥16 mg/mL）槐定碱具有抑制作用，而低浓度（≤8 mg/mL）槐定碱无明显抑制作用。

表1 不同时期槐定碱对白色念珠菌BF形成的抑制率

2.5 槐定碱对白色念珠菌胞外蛋白活性的影响

2.5.1 槐定碱对白色念珠菌胞外蛋白酶活性的影响

牛乳平板法试验结果表明（图4），白色念珠菌分别与浓度为16 mg/mL、8 mg/mL及4 mg/mL槐定碱溶液共同培养后的上清液于牛奶培养基中培养6 h后未见透明水解圈，相同条件下的阴性对照组也未见透明水解圈，而阳性对照组（蛋白酶K）具明显透明水解圈，可推断槐定碱对于白色念珠菌的胞外蛋白酶活性没有影响。

图4 不同浓度槐定碱溶液对白色念珠菌胞外蛋白酶活性的影响

2.5.2 槐定碱对白色念珠菌磷脂酶活性的影响

参照1.2.6槐定碱对白色念珠菌磷脂酶活性的影响所述，白色念珠菌磷脂酶活性与PZ值的关系由图5a～5d分析可知槐定碱对白色念珠菌磷脂酶活性具有抑制作用，其浓度为16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL时，抑制磷脂酶活性作用明显，PZ值分别为1、0.98±0.01和0.74±0.02，而阴性对照组PZ值为0.73±0.01，说明磷脂酶活性随着槐定碱浓度的增加而降低，并呈一定的浓度依赖关系。

图5 不同浓度槐定碱溶液对白色念珠菌胞外蛋白的影响

2.6 槐定碱对白色念珠菌胞外DNA活性的影响

根据白色念珠菌总DNA琼脂糖电泳图结果显示（图6），终浓度为32 mg/mL、16 mg/mL、8 mg/mL对应泳道内的DNA并未被降解，因此判定浓度为32 mg/mL、16 mg/mL、8 mg/mL的槐定碱溶液对白色念珠菌胞外DNA没有作用。

图6 不同浓度槐定碱溶液对白色念珠菌胞外DNA的影响

3 讨论

生物碱是一种具有较强生物活性的碱性含氮化合物，是许多药用植物的药理活性成分［30］。OZCELIK B等［31］研究发现长春碱和葫芦巴碱对白色念珠菌的MIC值分别为4 μg/mL和8 μg/mL，均低于其他生物碱。天仙藤中roemerine对白色念珠菌只有微弱的抑制作用［32］，但是能显著抑制其形态转变和BF形成，且呈浓度依赖关系［33］。SHAO J等［18］从苦参中提取的苦参碱能抑制白色念珠菌的BF表型以及菌丝形成。袁琳琳［25］报道白色念珠菌的不同生长阶段、表面疏水性、BF胞外基质和毒力基因均可影响白色念珠菌BF的形成，但槐定碱并不通过抑制白色念珠菌胞外蛋白的活性和降解白色念珠菌胞外DNA的方式来抑制其BF形成。利用qRT-PCR技术对白色念珠菌相关基因的研究表明［34-36］，可通过下调白色念珠菌hwp1、als3、efg1等相关毒力基因的表达来抑制白色念珠菌BF的形成。

本试验结合槐定碱对白色念珠菌MIC值测定以及16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL槐定碱对白色念珠菌BF作用后的形态学观察结果分析，发现当槐定碱浓度≥8 mg/mL时，白色念珠菌的生长受到抑制，形成BF的能力有明显的下降，说明槐定碱对白色念珠菌的生长有显著抑制作用。通过卵黄平板法发现，当槐定碱浓度≥8 mg/mL时可通过抑制白色念珠菌磷脂酶活性来减弱白色念珠菌的毒力影响，这个结果与高明［28］所研究的钙通道阻滞剂与氟康唑联用抗白色念珠菌的毒力因子作用结果类似。而在槐定碱浓度为16 mg/mL时的平皿中未见到单菌落，因此判断该浓度下白色念珠菌的磷脂酶无活性。而槐定碱浓度为8 mg/mL、4 mg/mL时，磷脂酶活性依次增强，说明槐定碱浓度越高，其抑制白色念珠菌磷脂酶活性越明显，并呈浓度依赖关系。

白色念珠菌作为人体常见的机会性致病真菌，其BF为其粘附在生物与非生物物质表面提供了帮助，白色念珠菌的粘附能力与其本身的毒力是呈正相关性的。通过MIC值的测定、形态学观察以及对白色念珠菌胞外蛋白和胞外DNA等研究，发现当槐定碱浓度≥8 mg/mL时，白色念珠菌的生长受到抑制，说明槐定碱可通过抑制白色念珠菌生物量来抑制其BF的形成，使其黏附能力下降，从而导致毒力减弱。本试验为设计和治疗白色念珠菌感染的相关药剂提供理论基础。

4 结论

本研究发现，槐定碱对白色念珠菌MIC值为8 mg/mL；通过光学显微镜观察发现槐定碱浓度增加会使白色念珠菌的数量减少及其形成BF能力下降；通过扫描电子显微镜观察到浓度为4 mg/mL的槐定碱会使白色念珠菌表面形成凹陷；在测定不同时期槐定碱对白色念珠菌BF形成的抑制率时发现16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL的槐定碱溶液对白色念珠菌BF的黏附期和生长期具有明显的抑制作用，而进入成熟期后抑制作用减弱，且只有在浓度为16 mg/mL时有抑制作用，说明槐定碱对白色念珠菌BF形成有一定的影响；此外，浓度为16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL的槐定碱溶液对白色念珠菌胞外DNA和胞外蛋白酶无影响，当槐定碱浓度≥8 mg/mL时对磷脂酶活性有明显抑制作用，并呈一定的浓度依赖关系。