黄芪注射液对病毒性心肌炎患者外周血Th17 及Treg 细胞亚群的影响*

杨闻君，罗秋林，张 强

1 重庆市红十字会医院/江北区人民医院，重庆 400020；2 重庆市人民医院；3 陆军军医大学第一附属医院

病毒性心肌炎是由流感病毒、腮腺病毒及柯萨奇B 型病毒等引起的心肌局限性或弥漫性炎性病变。近年来，有研究显示［1］，病毒性心肌炎发生、发展过程与病毒感染后机体炎症反应的过度激活密切相关。T 淋巴细胞是炎症反应激活与放大的重要组成部分，作为炎症反应的上游调控因子，参与了众多炎症性疾病的发生、发展过程［2］。其中，辅助性T 细胞17（T helper cell 17，Th17）和调节性T 细胞（regulatory cell，Treg）是与炎症性疾病发病及进展相关的重要T淋巴细胞亚群［3］。目前，对于病毒性心肌炎的治疗，常以综合治疗（药物、饮食及休息）为主，药物治疗方面，中西医结合显示出了独特优势［4］。特别是以黄芪注射液为代表的中成药物，可抑制机体炎症反应，提高临床疗效［5］，但黄芪注射液对Th17/Treg细胞亚群的影响尚未见报道。因此，本研究探讨黄芪注射液对病毒性心肌炎患者外周血Th17/Treg 细胞亚群及相关下游炎性通路的影响，阐明其作用机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料将2016年1月至2019年10月于重庆市红十字会医院就诊的病毒性心肌炎患者140 例根据随机数字表法分为观察组和对照组各70 例。观察组中男37 例，女33 例；年龄35～78岁，中位年龄58.1 岁；平均病程（4.3±0.6）天；合并基础疾病：高血压43 例，糖尿病36 例，冠心病29 例。对照组中男35 例，女35 例；年龄35～79岁，中位年龄58.7 岁；平均病程（4.5±0.8）天；合并基础疾病：高血压45例，糖尿病35 例，冠心病28例。两组患者性别、年龄、病程、基础疾病等比较差异无统计学意义（P＞0.05）。该研究获得了我院伦理委员会的批准并征得了患者书面知情同意。

1.2 纳入标准符合病毒性心肌炎诊断与治疗指南［6］。

1.3 排除标准1）患有冠心病、感染性心内膜炎及心脏瓣膜病者；2）存在自身免疫性疾病和免疫缺陷者；3）恶性肿瘤患者；4）对黄芪注射液过敏者。

1.4 主要设备及试剂FACS型流式细胞仪（美国BD公司）；RPMI 1640细胞培养基（货号：11875119）、莫能霉素（货号：00-4505-51）、淋巴细胞分离液（货号：4414173）、细胞固定液（货号：R37814）、细胞破膜剂（货号：GAS002S5）均购自美国eBioscience公司；离子霉素（货号：56092-81-0）、佛波酯（货号：HY-18739）均购自美国MedChemExpress 公司；胎牛血清（美国HyClone 公司，货号：PM150110）；单克隆抗体CD4（货号：PA5-32324）、IL-17（货号：PA1-86898）及CD25（货号：MA1-12116）均购自美国Invitrogen公司；白细胞介素17(interleukin-17，IL-17，货号：H014-1）、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6，货号：H007-1-1）及转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β，货号：H034-1）酶联免疫试剂盒均购自中国南京建成生物公司。

1.5 治疗方法

1.5.1 对照组 予抗病毒、维生素C 片、极化液、辅酶Q10 胶囊、盐酸曲美他嗪片及抗心律失常等对症及支持治疗。共治疗2周。

1.5.2 观察组 在对照组的基础上加用黄芪注射液［哈尔滨圣泰生物制药；国药准字Z23 020820；规格：10 mL/支（相当于原药材20 g）］20 mL，加入5%葡萄糖注射液250 mL 静脉滴注，每日1 次。共治疗2周。

1.6 观察指标

1.6.1 外周血Th17和Treg细胞亚群水平检测 抽取两组患者治疗前后静脉血4 mL，经肝素抗凝后，去抗凝血200 μL 于EP 管中，将其加入等体积的RPMI-1640 培养基，接种于培养板，同时加入佛波酯（30 μL，1 μg/mL）、离子霉素（16 μL，50 μg/mL）及莫能霉素（16 μL，0.1 mg/mL），培养箱中孵育4 h。取100 μL上述培养液，加入抗人CD4和CD25单克隆抗体10 μL，震荡混匀后室温避光孵育15 min，加入100 μL细胞固定液。再次室温避光孵育15 min后，4 ℃离心半径15 cm，2991 r/min 离心5 min，弃上清后加入100 μL 破膜液，同时加入IL-17 单克隆抗体10 μL 和Foxp3 抗体10 μL，震荡混匀后，待上机检测。

1.6.2 外周血炎性指标检测 治疗前后采用ELISA法测定患者外周血IL-6、IL-7和TGF-β水平。

1.6.3 心肌损伤标志物检测 治疗前后检测患者肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CKMB）、心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）及肌红蛋白（myoglobin，MYO）。

1.6.4 疗效标准 参照成人病毒性心肌炎诊断与治疗指南标准［6］，依次分为临床治愈、显效、有效及无效。

总有效率（%）=临床治愈率+显效率+有效率

1.6.5 不良反应 记录患者治疗期间不良反应发生情况，包括恶心呕吐、头痛、腹部不适等。

1.7 统计学方法采用SPSS 19.0 软件分析数据，计量资料以表示，采用t检验；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血Th17和Treg细胞亚群水平治疗后两组患者外周血Th17细胞和Th17/Treg比值较治疗前降低（P＜0.05），观察组降低更明显（P＜0.05）；Treg 细胞升高（P＜0.05），观察组升高更明显（P＜0.05）。见表1。

表1 两组患者治疗前后外周血Th17和Treg细胞亚群水平比较（）

表1 两组患者治疗前后外周血Th17和Treg细胞亚群水平比较（）

注：*表示与治疗前比较，P＜0.05；#表示与对照组治疗后比较，P＜0.05

2.2 血清IL-6、IL-17 和TGF-β 水平治疗后两组患者IL-6和IL-17低于治疗前（P＜0.05），观察组低于对照组（P＜0.05）；TGF-β高于治疗前（P＜0.05），观察组高于对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 两组患者治疗前后血清IL-6、IL-17和TGF-β 水平比较（）ng/L

表2 两组患者治疗前后血清IL-6、IL-17和TGF-β 水平比较（）ng/L

注：*表示与治疗前比较，P＜0.05；#表示与对照组治疗后比较，P＜0.05

2.3 心肌损伤标志物水平治疗后两组患者心肌损伤标志物（CKMB、cTnI、MYO）水平均较治疗前降低，观察组低于对照组（P＜0.05），见表3。

表3 两组患者治疗前后心肌损伤标志物水平比较（）μg/L

表3 两组患者治疗前后心肌损伤标志物水平比较（）μg/L

注：*表示与治疗前比较，P＜0.05；#表示与对照组治疗后比较，P＜0.05

2.4 临床疗效观察组总有效率为92.9%，高于对照组的82.9%，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 两组患者临床疗效比较［n（%）］

2.5 不良反应发生情况治疗期间，对照组出现恶心呕吐1 例、头痛1 例；观察组出现恶心呕吐1例、头痛1例、腹部不适1例，两组不良反应发生率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

病毒性心肌炎是病毒感染引起的心肌非特异性炎症性疾病，在心肌局部或弥漫性的炎性细胞浸润，可导致心肌细胞凋亡及坏死。多数心肌炎预后较好，但少部分可发展为重症心肌炎，若不及时救治可导致患者猝死。中医认为病毒性心肌炎属“温病”“胸痹”范畴，发病源于气阴两虚，治疗强调益气养阴，活血化瘀［7］。相关研究显示，黄芪注射液可提高病毒性心肌炎患者临床疗效，但机制不清［8］。

研究显示，病毒感染后，机体可通过固有免疫激活Toll 样受体2，促进外周血单核细胞分泌相关炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α），聚集于心肌局部形成炎症反应，发挥免疫应答作用［9］。除了固有免疫外，有研究显示，Th17 细胞及其特异性分泌的IL-17 在病毒性心肌炎的免疫损伤和炎症反应中发挥重要作用，该类患者体内Th17 和IL-17水平升高［10］。Th17细胞作为一种辅助性T细胞亚群，特异性分泌IL-17，参与众多炎症及自身免疫性疾病的发生、发展过程［11］。有研究显示，通过抑制Th17 细胞活化，可抑制机体炎症反应的激活与放大，对于改善炎症性疾病的进展发挥重要作用［12］。黄芪具有益气固表、补脾实卫、托疮生肌等功效。本研究对病毒性心肌炎患者给予黄芪注射液治疗，结果显示，黄芪注射液可降低外周血Th17 细胞水平，升高Treg 细胞亚群水平，从而抑制下游炎性通路的级联放大。Th17 细胞是一类CD4+T 细胞亚群，可通过分泌相应炎性细胞因子，介导促炎反应。Treg 细胞是CD4+T 细胞亚群之一，可调节机体免疫功能，抑制过度免疫反应引起的组织细胞损伤。近年来，相关研究显示，Treg细胞与Th17 细胞在功能上相互拮抗，在生理上维持平衡状态，保持机体免疫功能稳定，而一旦机体遭遇病毒或细菌感染，可导致Th17细胞与Treg细胞亚群的平衡失调，进而促进炎症反应的级联放大［13］。黄芪注射液降低病毒性心肌炎患者炎症反应的机制可能如下：1）抑制Th17 细胞活化，降低IL-17 水平，抑制下游炎性通路激活；2）促进Treg细胞亚群升高，引起TGF-β水平增加，进而抑制机体核转录因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)活化，降低心肌细胞的损伤与凋亡。通过抑制炎症的激活与放大，可进一步减轻心肌损伤，给予黄芪注射液治疗后心肌损伤标志物（CKMB、cTnI 及MYO）水平较治疗前降低。黄芪注射液可提高病毒性心肌炎临床疗效，同时不增加不良反应的发生率。说明黄芪注射液在提高临床疗效的同时，安全性较好。

综上所述，黄芪注射液可改善病毒性心肌炎患者免疫功能，逆转外周血Th17和Treg细胞亚群失衡，降低机体炎性通路的激活与放大，进一步减轻心肌细胞损伤，提高临床疗效。鉴于本研究入选样本量偏少、随访时间短，今后需进一步加大样本量，延长随访时间来观察黄芪注射液对病毒性心肌炎患者外周血Th17和Treg细胞亚群的影响。