基于网络药理学研究血府逐瘀汤治疗中晚期气滞血瘀型肺癌的作用机制

徐 旭，侯恩存，熊佳惠，赵艺蔓

1 广西中医药大学，广西 南宁 530000；2 广西中医药大学附属瑞康医院

近年来，肺癌发病人数逐年增高，已成为当今人类所面临的肿瘤疾病的首要组成部分［1-2］。目前认为肿瘤的发病机制是由多种因素影响激活原癌基因导致细胞癌变。分子生物学研究表明［3-5］，肿瘤的发病与表观遗传、miRNA、lncRNA 等密切相关。而且不同肺癌患者在治疗时常存在特异性。因此，肿瘤基因、靶点、信号通路的研究能对其发病机制、疾病预防、药物治疗起促进作用。

血府逐瘀汤是王清任《医林改错》中五逐瘀汤中的一首方剂，由桃仁、红花、当归、生地黄、牛膝、川芎、桔梗、赤芍、枳壳、甘草、柴胡等11 味药组成。主要用于冠心病、心肌梗死、脑梗死、高血压等心血管疾病和骨折、软组织损伤及多种手术术后治疗等，起活血化瘀，行气止痛作用。彭涛等［6］对90 例肺癌中晚期患者进行随机对照研究发现血府逐瘀汤能够有效改善中晚期肺癌患者血液高凝状态，预防静脉血栓形成。丁志山等［7］通过牛内皮细胞实验表明血府逐瘀汤通过抑制血管生成起抗肿瘤作用。本研究首次采用网络药理学方法整合血府逐瘀汤中多种药物蛋白作用网络与肺癌网络，从蛋白、基因角度揭示血府逐瘀汤治疗肺癌的相关机制。

1 材料与方法

1.1 数据库中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/index.php）；Batman数据库（a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine，http：//www.batman.com）；PharmMapper Server 数据库（http：//pharmmapper/index.php）；String 数据库（http：//www.String-db.org/）；Drugbank 数据库（https：//www.Drugbank.ca/）；GAD数据库（Genetic Association Database，http：//geneticassociationdb.Nih.gov）；在线孟德尔人类遗传数据库（online mendelian inheritance in man，OMIM，http：//www.omim.org）；CTD 数据库（Comparative Toxicogenomics Database，http：//ctd.mdibl.org/）；GeneCard数据库（http：//www.genecards.org/）；DAVID 数据库（https：//david-d.ncifcrf.gov/home.jsp）；KEGG 数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http：//www.kegg.com）；KOBAS 数据库（http：//kobas.cbi.pku.Edu.cn/download.php）；Metascape 数据库（http：//www.matascape.com/）

1.2 血府逐瘀汤有效成分和核对采用TCMSP数据库及Batman 数据库收集血府逐瘀汤方剂中柴胡、生地黄、赤芍、川芎等11 味中药的化学成分。因血府逐瘀汤通常采用口服用药，因此以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，药物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18 为限定条件对所收集到的化学成分进行筛选［8］。筛选出血府逐瘀汤的活性成分并下载保存为Mol2 格式，结合DrugBank 数据库检索化合物的详细信息并进行确认核对，最后得到血府逐瘀汤的有效成分。

1.3 血府逐瘀汤化学成分靶点预测将初步筛选出的活性成分进行文献检索，将Mol2 格式的全部文件上传至Pharmmapper服务器［9］，并设定返回标准。将得到的返回靶点结果在Uniprot数据库、String数据库中进行核对，选择物种为人类（Homo.sapiens），蛋白质ID转化为基因名称（Gene Symbol）并剔除不规范、非特定指代命名靶点，以确保靶点的可获得蛋白互作网络图，并将相关数据保存为TSV格式。将TSV格式文件导入Cytoscape 3.6.1软件，并设计图形参数，进行分析。其中节点表示成分和靶点，边表示成分与靶点之间的相互作用，进一步设置节点大小与颜色反映Degree 值大小，边的粗细反映Combined score 大小，最终获得蛋白质相互作用网络。

1.4 肺癌相关靶点获取从OMIM 数据库［10］、GAD数据库［11］、CTD 数据库［12］中获得肺癌相关靶点，以肺癌为关键词进行搜索，获得与肺癌相关的靶点，并将3个数据库得到的靶点进行对比筛选。

1.5 血府逐瘀汤和肺癌相关靶点分析将血府逐瘀汤化学成分靶点与肺癌靶点进行核查比对，利用Venny分析工具，比对分析两组靶点。将靶点导入Metascape数据库，设置物种为人类（sapiens），得到相关数据和PPI图。

1.6 血府逐瘀汤治疗肺癌预测靶标富集分析将血府逐瘀汤潜在靶点上传到David 数据库。依次勾 选OFFICIAL GENE SYMBOL、Genelist、Submit list，修改背景为人类（Homo.sapiens），再分别勾选生物过程（biological process，BP）、分子功能（cellular component，CC）、细胞成分（molecular function，MF）。选择生物使用KOBAS 数据库和metascape 数据库对靶点进行生物途径富集分析。通过KEGG 数据库查找富集出的生物通路图，并利用metascape数据库将得到的KEGG生物途径结果制作成条形图。

2 结果

2.1 有效成分筛选通过TCMSP 数据库搜集到226 个化合物，其中柴胡17 个，赤芍29 个，川芎7个，当归2个，甘草92个，红花22个，桔梗7个，牛膝20 个，地黄2 个，桃仁23 个，枳壳5 个。其中包括共有化合物11 个：赤芍、当归、红花、牛膝、桃仁、枳壳的共有化合物为β-谷固醇，柴胡、赤芍、当归、红花、牛膝、生地黄的共有化合物为豆固醇，柴胡、甘草、红花、牛膝的共有化合物为槲皮素，赤芍、川芎、甘草、生地黄的共有化合物为谷固醇，柴胡、甘草、红花、牛膝的共有化合物为山柰酚，柴胡、赤芍、红花、牛膝的共有化合物为黄芩苷，赤芍、红花、牛膝的共有化合物为黄芩素，赤芍、桔梗、牛膝的共有化合物为菠固醇，红花、桔梗的共有化合物为木犀草素，柴胡、甘草的共有化合物为异鼠李素，甘草、枳壳的共有化合物为柚皮素。OB值排名前50的化合物见表1。

表1 血府逐瘀汤有效成分（前50名）

续表1

2.2 血府逐瘀汤化学成分潜在靶点预测及相互作用将得到的各Mol2 结果上传至PharmMapper数据库，返回的潜在预测靶点共2394 个，对潜在靶点在DrugBank 数据库中筛选和进行去除重复后得到290 个蛋白，并在Uniprot 数据库、String数据库中进行核对后剔除非人类和不规范、非特定指代命名以及重复的靶点后，共得到262 个靶点，其中不同颜色的节点代表不同的靶点，共得到262 个靶点，边线代表两个靶点间的相互关系，边线越多，关联的靶点越多，共计2112 条。平均节点为16.1，平均局部聚类系数为0.464。见图1。

图1 血府逐瘀汤化学成分潜在靶点预测及相互作用PPI图

2.3 肺癌相关靶点获取从OMIM数据库、GAD数据库、CTD 数据库中分别获得肺癌相关靶点共126820 个，筛选去重后得到37774个不重复靶点，包括血清α-1-B 糖蛋白（A1BG）、α-2-巨球蛋白（A2M）、n-乙酰转移酶1（NAT1）、n-乙酰转移酶2（NAT2）、芳基乙酰胺脱乙酰酶（AADAC）等，部分靶点见表2。

表2 肺癌相关部分靶点

续表2

2.4 血府逐瘀汤与肺癌蛋白互作血府逐瘀汤靶点与肺癌相关靶点相互交集的韦恩图表明有258个共有靶点。见图2。

图2 血府逐瘀汤靶点与肺癌相关靶点相互交集韦恩图

2.5 血府逐瘀汤治疗肺癌的靶点和通路GO 富集将共有靶点258 个输入DAVID、Metascape、KOBAS 网站进行基因本体论功能富集分析（gene ontology，GO），得到2833 个BP，1521 个细胞组成CC，2886个分子功能MF。综合P值较高的靶点包括TP53、Bcl-2、Akt1、EGFR、RELA、PTGS2 等。BP、CC、MF的P值前20的靶点见图3—5。

图3 血府逐瘀汤治疗肺癌的靶点和通路GO富集（BP，P值前20）

图4 血府逐瘀汤治疗肺癌的靶点和通路GO富集（CC，P值前20）

图5 血府逐瘀汤治疗肺癌的靶点和通路GO富集（MF，P值前20）

将KEGG 富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、Gene Pathway、CORUM结果综合后发现所有靶点共有通路1893 条，其中以Log10（P值）最大的20 个通路形成条形。见图6、表3。

表3 部分共有靶点通路

图6 Log10（P值）最大的20个通路条形图

结合Metascape 形成对应的富集，见图7，其中同种颜色的节点代表在同一个信号通路上的靶点，相应P值对应分布图见图8，节点颜色变化代表P值变化。

图7 结合Metascape形成的对应富集图

图8 同种颜色的节点代表在同一个信号通路上的靶点及相应P值对应分布

结合MCODE 插件得到血府逐瘀汤和肺癌共同靶点的模块化分析见图9—11。图9 为所有模块的集成图像，不同颜色代表不同的模块。图10 是部分靶点组合的8 种模块的细节结构图。对每个MCODE模块通过GO分析，保留其中前3个最佳P值项，得到表4 结果。其中MCODE7 靶点聚类后模块由sod1、pygm、akr1c1 靶点构成，三者没有共同通路。将各聚类模块进行汇总分析得出P值最高的3条通路：（hsa05200Pathways in cancer）Log10（P）=-56.5；hsa05161（Hepatitis B）Log10（P）=-55.8；hsa05215（Prostate cancer）Log10（P）=-38.6。对所有信号通路进行汇总分析得出P值最高的3条：hsa05200（Pathways in cancer）Log10（P）=-61.3；R-HSA-6785807（Interleukin-4 and Interleukin-13 signaling）Log10（P）=-52.0；GO：0010035（response to inorganic substance）Log10（P）=-49.7。总结P值较高的通路包括hsa05200：Pathways in cancer；R-HSA-6783783：Interleukin-4 and Interleukin-13 signaling）；GO：0010035（response to inorganic substance）等通路。总之，血府逐瘀汤中多个活性成分可能通过(tumor portein p53，TP53)、B 淋巴细胞瘤2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase，Akt1）等靶点通过hsa05200、R-HSA-6783783、GO：0010035 等的多种信号通路起治疗肺癌的作用。

表4 模块中P值排在前三的通路

图9 血府逐瘀汤和肺癌共同靶点的模块集成图

图10 部分靶点组合的8种模块的细节结构图

3 讨论

肺癌属中医学“肺积”“胸痛”“咯血”“咳嗽”等范畴，《素问·奇病论篇》《灵枢·邪气脏腑病形》《难经》中均有类似记载，《伤寒论》《金匮要略》中提出了最早的治疗方法。现代中医将肺癌多归于体虚导致气滞、血瘀、痰凝、毒聚入内致病。其治则也因不同医家不同辨证而不同，主要为补气滋阴、活血化瘀、健脾化痰等，其中刘嘉湘教授［13］提出“扶正治癌”法；蔡小平教授［14］提出“瘀阳论、瘀阴论”，并总结出解毒散结方；马纯政教授［15］认为肺癌多由痰湿所致，主张行气化痰，调理脾肾；徐景毅教授［16］强调扶正与驱邪共进，再因人施治。王淑美等［17］通过评估名家医方、孙婕怡［18］通过近30 年中医相关文献数据挖掘结果看出活血化瘀是治疗肺癌的重要方法之一。血府逐瘀汤是治疗气滞血瘀型肺癌的代表方剂。

血府逐瘀汤的抗癌机制相关研究较少。部分药理学及临床研究表明血府逐瘀汤有一定的抗肿瘤作用。叶向荣等［19］通过观察腹水型肝癌（H22）淋巴管转移小鼠发现血府逐瘀汤能有效抑制癌细胞淋巴管转移。董强等［20］对80 例中晚期小细胞肺癌患者给与EP 方案+血府逐瘀汤的随机对照研究，结果表明血府逐瘀汤可改善患者血液高凝状态，增强化疗药物的疗效。

3.1 血府逐瘀汤有效化合物分析本研究共得到226个化合物，其中包括11个共有化合物［β-谷固醇、豆固醇、槲皮素、谷固醇、山柰酚、黄芩苷、黄芩素、菠固醇、木犀草素、异鼠李素。对比孙明谦等［21］采用多级离子阱质谱仪对血府逐瘀汤中的化合物进行质谱和碎片离子的解析结果，尹爱武等［22］利用色谱学对血府逐瘀汤进行系统分离，并对得到的化合物进行结构鉴定，发现血府逐瘀汤制剂未有新化合物产生。β-谷固醇作为一种广泛存在于多种植物的化合物。有研究表明，β-谷固醇能诱导乳腺癌、结肠癌、宫颈癌和前列腺癌细胞DNA发生细胞凋亡，起抗增殖作用［23-24］。有研究表明，β-谷固醇能抑制a549细胞生长，并通过ROS介导的线粒体失调引发非小细胞肺癌细胞凋亡，而不损害肺和PBMC 细胞［25］。实验结果表明，豆固醇有明确的抗皮肤癌作用并能通过抑制肿瘤血管生成抑制胆管癌生长［26-28］；槲皮素已经被较多实验证实能抑制肺癌细胞生长［29-31］，并且已经被用于肺癌的靶向药物研发［32］。

在血府逐瘀汤所有化合物中桃仁、甘草所含化合物OB 较高，在前50 中占62%。桃仁中的赤霉素在血府逐瘀汤所有化合物中有101.61%的OB。赤霉素是植物生长过程的重要激素。GA-13315作为一种赤霉素的衍生物能对肺腺癌起较好的抗肿瘤作用，并能部分通过阻碍ABCB1的外排功能而使多药耐药细胞变得敏感［33-34］。甘草的化合物DL普遍较高，其中最高的是甘草中的Shinpterocarpin。甘草作为中药方中常见药物，通常在全方中作为佐使药，起到引经、补益和调和诸药的作用。目前已知的甘草成分超过280 种，主要有黄酮类、三萜皂苷类、生物碱类、甘草葡聚糖类等成分，其中部分已经被证实对肺癌有积极作用。CHANGLIANG CHEN 等［35］通过各种甘草成分对非小细胞肺癌的H1299、A549、H1975 和H2228 细胞进行Transwell和创伤愈合实验，证明异甘草素能有效抑制肺癌细胞迁移和生长。CHENYU QIU 等［36］对非小细胞肺癌A549 和H460 细胞的实验结果表明Licochalcone A（LicA）能通过诱导G2/M 细胞周期阻滞和雌激素受体应激抑制肺癌细胞的增殖。SO YOUNG PARK 等［37］将18β-GA 作用于NCI-H23、NCIH460、A549 和16HBE-T 细胞，结果表明18β-GA 可能通过抑制血栓素的作用抑制肺癌细胞增殖。综上可知，血府逐瘀汤中成分复杂多样，部分化合物如β-谷固醇、赤霉素、甘草素可通过抑制癌细胞增殖、迁移等作用治疗肺癌，但也有部分化合物（如Shinpterocarpin）缺乏相关实验证明其作用。而针对血府逐瘀汤成方成分的相关研究较少，不排除有新化合物生成而未被发现的可能，希望有更多新技术应用于相关研究。

3.2 血府逐瘀汤和肺癌共同靶点分析本研究共得到血府逐瘀汤和肺癌共有靶点258 个，占血府逐瘀汤有效靶点的98.47%，占肺癌靶点的0.7%，说明血府逐瘀汤有相当多的靶点可作用于肺癌，证明血府逐瘀汤可以直接对肺癌起作用。

将靶点经过DAVID、Metascape、KOBAS 等多个数据库综合分析发现，其中P值较高、关系密切的靶点包括：TP53、Bcl-2、Akt1。随着基因测序的发展，发现肿瘤的发生、发展和基因密切相关。TP53作为一种抑癌基因，对包括肺癌、食道癌、直肠癌、宫颈癌在内的多种肿瘤细胞生长、衰老、凋亡起重要作用。其致癌原因主要是结构和性质的改变，可与其他致癌蛋白（例如Ets2、AMPK）或肿瘤抑制蛋白（例如TP63、TP73）结合。目前已知TP53有18个外显子，而且存在较高的突变率。但是也有较多研究证实，TP53 作为癌基因的同时也有抑癌基因作用［36-40］。TP53 突变（MUTP53）结构的差异性将影响不同肿瘤类型的发展［41］，通过MUTP53 和EGFR突变可以更准确地预测非小细胞肺癌患者预后［42］。有研究指出TP53 和家族性肿瘤突变密切相关［43］。MUTP53 和吸烟相关，并能增加吸烟后患肺癌的几率［44］。TP53 不仅为靶向治疗和免疫治疗的重要靶点，还能调节部分药物如顺铂的化疗反应［45］。

Bcl-2 是可以影响癌细胞凋亡的重要基因。Bcl-2 家族中的Bad、Bim、Bax 等基因具有促凋亡作用，而Bcl-2、Bcl-XL 和Mcl-1 等基因有拮抗凋亡的作用。有研究指出，Bcl-2 家族的基因单核苷酸多态性不仅影响小细胞肺癌的易感性，也与非小细胞肺癌铂类药物化疗结果相关［46-47］。血府逐瘀汤是通过Bcl-2 靶点拮抗肺癌细胞凋亡，还是抑制Bcl-2 基因的达到抗肿瘤作用，有待进一步研究。

Akt家族包括Akt1、Akt2和Akt3，在调节细胞生长、增殖、转移方面有突出作用。一般认为，Akt1影响了胃肠道肿瘤细胞，Akt2作用于乳腺、卵巢等方面。但有新研究发现［48］，Akt1 的抑制促进了KRAS 或表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)突变的非小细胞肺癌细胞小鼠的脑转移程度。CHUNLING ZHANG 等［49］通过对不同患者的肺癌样本中的PICART1 的研究发现高表达的PICART1 能通过AKT 信号通路抑制非小细胞肺癌细胞生长和侵袭，并诱导细胞周期停滞在G2/M期。血府逐瘀汤可以通过AKT调节肺癌细胞的转移作用。

综上所述，血府逐瘀汤可能通过TP53 抑制肺癌细胞的生长、衰老、凋亡，通过Bcl-2 靶点调节肺癌细胞凋亡，通过AKT调节肺癌细胞转移。

3.3 血府逐瘀汤和肺癌共同信号通路分析血府逐瘀汤和肺癌共同通路中P值较高的有：肿瘤通路（hsa05200：Pathways in cancer）、白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)和白细胞介素13(interleukin-13，IL-13)信号传导（R-HSA-6783783：Interleukin-4 and Interleukin-13 signaling）、信号传导（R-HSA-162582：Signal Transduction）、免疫系统（R-HSA-168256：Immune System）、白细胞介素的信号传递（R-HSA-449147：Signaling by Interleukins）、免疫系统中的细胞因子信号传导（R-HSA-1280215：Cytokine Signaling in Immune system）等血府逐瘀汤和肺癌相对重要通路。hsa05200代谢图包含了CASP3、HER-2、Bcl-2、STAT3、p53 等众多基因和较多通路，如：cAMP 通路、VEGF 通路、MAPK 通路、PI3K-Akt 通路、PPAR 通路等。MAPK 通路是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要路径。中间包括MAPK激酶激酶（MAP kinase kinase kinase，MKKK）、MAPK 激酶（MAP kinase kinase，MKK）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）3 种激酶。有研究发现，醛固酮、TUC338、fascin-1、Epigallocatechin-3-Gallate 均能通过MAPK 通路调节非小细胞肺癌细胞［50-53］。这些研究涉及的激素、非编码核糖核酸、蛋白不仅帮助我们更好地了解MAPK 通路作用机制，也为相关药物研发打好基础。也有研究指出，环腺苷酸（camp）信号是抗肿瘤治疗的重要靶点［54-55］。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)通路已经成为治疗肺癌的重要方式，目前抗VEGF药物贝伐珠单抗被NCCN 指南推荐为治疗肺癌的一线药物。比较VEGF的作用，可以看出血府逐瘀汤在促进血管生长的同时有抑制血管生长的作用［56］。

本研究通过网络药理学证实血府逐瘀汤可以通过TP53、Bcl-2、EGFR、akt1 等靶点及通过hsa05200、R-HSA-6783783、R-HSA-162582、R-HSA-168256、R-HSA-449147 中 的cAMP、VEGF、MAPK、PI3K-Akt、PPAR 等多种信号通路达到抑制肿瘤生长、凋亡、转移的作用来治疗中晚期气滞血瘀型肺癌。但还存在相关药理学实验缺乏、检索数据库较少、数据库所收文献不全面、相关化合物和靶点未被数据库收录等不足。血府逐瘀汤对肺癌的作用复杂，需要有更多的相关研究和临床试验来验证其作用机制。充分利用血府逐瘀汤对中晚期气滞血瘀型肺癌的作用特点来扩展血府逐瘀汤的治疗范围和研发更适合中晚期气滞血瘀型肺癌治疗的药物。