基于网络药理学探究芪参益气滴丸治疗缺血性脑卒中的药理学作用机制*

贾壮壮，陈红阳，袁 庆，赵 磊，殷孟兰，徐 耀，王少峡，柴丽娟，胡利民

天津中医药大学中医药研究院/天津市中药药理学重点实验室/方剂学教育部重点实验室，天津301617

脑卒中具有高发病率、高致残率和高致死率的特点［1］，严重影响人们的生活质量，其病理机制复杂［2-4］，急性期涉及能量代谢障碍、氧化应激损伤、兴奋性氨基酸毒性、炎症反应及细胞凋亡等作用；亚急性期病理变化趋于缓和，各种始发因素和继发因素共同参与脑损伤的加重或修复；恢复期脑组织病理显示出现大量新生血管和神经修复。缺血性脑卒中属中医“中风”范畴，气虚血瘀是其主要病机之一，西医常规治疗难以达到满意效果，且受治疗时间窗限制；中药具有多组分、多靶点、多机制的作用优势，被广泛应用于脑卒中的治疗。

芪参益气滴丸由黄芪、丹参、三七、降香油组成，具有益气通脉，活血止痛功效，常用于治疗气虚血瘀型心血管疾病［5-7］。芪参益气滴丸所含化学成分复杂［8-9］，其对缺血性脑卒中的治疗效果及机制尚未明确，现利用网络药理学从分子水平揭示芪参益气滴丸治疗缺血性脑卒中的潜在核心靶点、功能及信号通路，阐明其多组分-多靶点-多机制的系统作用理念，为后期药物研发及临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 芪参益气滴丸活性化合物筛选与数据库构建通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）对芪参益气滴丸所含化合物进行查询汇总，再通过ADME 模块，设置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、药物相似性（Drug-likeness，DL）≥0.18、Caco-2 渗透性（Caco-2 permeability，Caco-2）≥-0.4、血脑屏障透过性（blood-brain barrier，BBB）≥-0.3、药物半衰期（drug half-life，HL）≥4 h进行活性化合物筛选，构建芪参益气滴丸活性化合物数据库。

1.2 潜在靶点预测及药物-靶点网络构建筛选出的药物靶点经蛋白质数据库UniProt（https：//www.uniprot.org/）检索，剔除重复蛋白，将蛋白转化为基因靶点，从而获得芪参益气滴丸活性化合物的潜在基因靶点，通过Cytospase 3.7.1 构建药物-靶点网络。

1.3 疾病-靶点数据库与药物-靶点网络融合通过在线孟德尔人类遗传数据库（online mendelian inheritance in man，OMIM）（http：//www.omim.org/）与疾病相关的基因与突变位点数据库DisGeNET（http：//www.disgenet.org/）收集缺血性脑中风治疗的相关靶点，构建缺血性脑中风相关靶点数据库。融合已经构建好的药物-靶点网络与疾病-靶点数据库，筛选出芪参益气滴丸治疗缺血性脑中风的潜在核心靶点。

1.4 潜在核心靶点之间蛋白互作网络分析将芪参益气滴丸治疗缺血性脑卒中的潜在核心靶点对应的基因名称输入蛋白质相互作用（PPI 网络）数据库STRING（https：//string-db.org/），建立蛋白互作网络（protein-protein interaction network，PPI network），将各个潜在核心靶点之间互相作用可视化。

1.5 基因本体论功能富集分析（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）/维基代谢通路（Wikipathway）信号通路富集分析利用Cytospase软件中Glue GO插件及cytoHubba插件进行Biological Process、Cellular Component、Molecular功能GO富集分析及KEGG/Wikipathway相关通路富集分析，综合预测芪参益气滴丸与缺血性脑卒中靶点的生物学作用及调控通路。

2 结果

2.1 芪参益气滴丸活性化合物信息筛选芪参益气滴丸所含化合物，剔除重复化合物与缺少靶点的化合物，最终得出68 个活性成分，其中黄芪10个、丹参35个、三七4个、降香19个，见表1。

表1 芪参益气滴丸活性化合物信息（Top10）

2.2 药物-靶点调控网络通过分析68 个化合物，初步获得766 个潜在靶点；删除单味药内不同化合物的重复靶点，获得黄芪对应靶点71 个，丹参对应靶点91 个，降香对应靶点78 个，三七对应靶点57 个；删除4 味药物的重复靶点后获得芪参益气滴丸对应潜在治疗靶点108个。见图1。

图1 芪参益气滴丸药物-靶点调控网络

2.3 潜在核心靶点以“Ischemic Stroke”为关键词在Online Mendelian Inheritance in Man数据库及DisGeNET 数据库中查询缺血性脑卒中相关治疗靶点393个，与芪参益气滴丸对应的108个潜在靶点进行比对，筛选出24 个靶点与芪参益气滴丸108个潜在靶点重合。24个潜在靶点可能是芪参益气滴丸治疗缺血性脑卒中的潜在核心靶点，见表2。

表2 芪参益气滴丸治疗缺血性脑卒中的潜在核心靶点

2.4 潜在核心靶点PPI 蛋白互作网络将芪参益气滴丸治疗缺血性脑卒中的潜在核心靶点导入STRING数据库得到对应靶点蛋白互作PPI网络，包括24个节点、87条边，平均度值为7.25。其中节点为靶点蛋白，边为各蛋白之间互作关系，节点连接边数越多代表其在网络中的作用越重要。见图2。

图2 芪参益气滴丸

2.5 GO 富集分析及KEGG/Wikipathway 通路富集分析芪参益气滴丸治疗缺血性脑卒中的潜在核心靶点GO 功能富集分析结果显示，主要涉及调节活性氧（reactive oxygen species，ROS）代谢过程、一氧化氮（nitric oxide，NO）生物合成过程、脂质代谢、类固醇激素受体（steroid hormone receptor，SHR）活性、上皮细胞迁移、成纤维细胞增殖等，具体还可参与调节免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）合成、活性氮（reactive nitrogen species，RNS）代谢过程、白细胞趋化性的正向调节、B 淋巴细胞介导的免疫调节、适应性免疫应答的正向调节、巨噬细胞分化及吞噬作用调节、神经血管重塑及其他相关组织重塑的调控、血管内皮细胞迁移、调节血压、调节平滑肌收缩功能、DNA复制的负调节、磷脂酶活性调节等多个生物过程、细胞组成、分子功能。见图3。

图3 芪参益气滴丸潜在核心靶点GO功能富集分析

芪参益气滴丸治疗缺血性脑卒中的潜在核心靶点通路富集分析显示，主要涉及血管再生相关信号通路、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）信号通路、内皮素（endothelin，ET）信号通路、核受体信号通路、血管紧张素转化酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）信号通路、前列腺素信号通路、雌激素信号通路、叶酸代谢通路、花生四烯酸代谢通路、炎性细胞因子介导的信号通路等。见图4。

图4 芪参益气滴丸潜在核心靶点KEGG/Wikipathway信号通路富集分析

3 讨论

多组分、多靶点、多机制是中药防治疾病的优势及特点，网络药理学利用大数据资源，建立“药物-靶点-基因-疾病”相互作用网络，系统预测药物与疾病的网络关系，而中医的整体观念、辨证论治理论与网络药理学的系统分析高度一致，已被广泛应用于系统揭示中药对疾病作用的物质基础和效应机制［10］。芪参益气滴丸为益气活血代表方药，具有益气通脉、活血止痛的功效，临床用于治疗气虚血瘀型胸痹，而气虚血瘀是心肌梗死和缺血性脑卒中的共同病机［11-13］，益气活血法是缺血性脑卒中的重要治疗思路，本研究采用网络药理学方法，初步挖掘芪参益气滴丸治疗缺血性脑卒中的潜在物质基础及治疗机制。

通过构建芪参益气滴丸活性化学成分数据库，共筛选出68个活性成分，其中黄芪10个，丹参35 个，三七4 个，降香19 个；通过构建“药物-成分-靶点”网络，初步发现芪参益气滴丸68 个活性成分在防治缺血性脑卒中中主要作用于NR3C2、TNF、IL4、NOS3、MMP9、TGFB1、KDR、EDNRA、ESR2、PPARG、ADRA1A、LTA4H 等24 个潜在核心靶点；对潜在核心靶点进行GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析发现，潜在核心靶点可通过调节血管再生相关信号通路、OPN 信号通路、ET 信号通路、核受体信号通路、ACEI 信号通路、前列腺素信号通路、雌激素信号通路、叶酸代谢通路、花生四烯酸代谢通路、炎性细胞因子介导的信号通路等多个途径，参与调节ROS代谢过程、NO生物合成过程、脂质代谢、SHR 活性、上皮细胞迁移、成纤维细胞增殖、Ig合成、RNS 代谢、白细胞趋化性、B 淋巴细胞介导的免疫反应、适应性免疫应答、巨噬细胞分化及吞噬作用调节、神经血管重塑及其他相关组织重塑、血管内皮细胞迁移、血压调节、平滑肌收缩功能、DNA复制、磷脂酶活性调节等多个生物过程、细胞组成及分子功能。

在缺血性脑卒中急性期，巨噬细胞、淋巴细胞及中性粒细胞等炎性细胞持续释放黏附因子、趋化因子等炎症介质，进而介导了炎症级联反应，加重脑缺血再灌注损伤［14］。炎性因子释放而形成的“瀑布效应”是重要的病理生理基础［15］，其中，TNF家族重要成员肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)的激活与血栓形成和血管反应密切相关，促使神经细胞凋亡，加剧脑损伤。有研究表明［16］，芪参益气滴丸可降低气虚血瘀型缺血性脑卒中患者TNF-α、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)等炎症因子表达水平。氧代谢在脑缺血损伤及神经退行性疾病中也发挥了重要作用，ROS主要由线粒体电子传递链中的复合体Ⅰ与Ⅲ产生［17］，通过多种信号通路参与调节脑缺血损伤后氧化应激及细胞凋亡，而一些抗氧化酶，如SOD 可消除过量ROS，调节细胞氧化应激；研究表明，芪参益气滴丸及黄芪、丹参、三七组分可上调SOD和CAT的基因表达，降低氮氧化物（nitrogen oxide，NOX）水平，进而抑制氧化应激及炎症反应，改善细胞能量代谢，对脑组织发挥保护作用以防缺血损伤［18-20］。

ET 和NO 是收缩和舒张血管的一对血管活性物质，在体内处于动态平衡状态，ET/NO 失衡可促进血栓形成与动脉粥样硬化，从而导致心脑血管疾病的发生发展，而NO 在脑缺血早期可通过舒张血管、抗血小板聚集等作用改善脑循环和脑缺血症状［21］。研究表明，芪参益滴丸可通过促进ET、NO 相对平衡进而调整心脏血管内皮功能，发挥血管内皮保护作用，为其通过调节ET及NO保护脑卒中后微血管以防损伤提供了依据［22］。

脂质代谢也参与了脑缺血损伤的多个病理环节［23］，芪参益气滴丸能够下调血清甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)浓度，上调高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)表达，调节脂质代谢，改善血脂异常。还可通过抑制转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表达下调心脏成纤维细胞增殖，在心血管疾病治疗和预后发挥良好作用［24］，为芪参益气滴丸治疗脑卒中提供了可能依据。

雌激素是重要的类固醇激素之一，可与ER 特异性结合，通过促进多种神经递质合成、调节能量代谢、抑制炎症反应和氧化应激等改善神经系统损伤［25］。黄芪可激活雌激素受体［26］；丹参的脂溶性成分丹参ⅡA 可与雌二醇(estradiol，E2)竞争核内ER，从而发挥雌激素样活性［27］；三七皂苷R1是三七的重要提取物之一，可通过雌激素受体调控ATF6/Akt 信号通路减轻脑缺血再灌注损伤［28］，以上研究为芪参益气滴丸通过调节雌激素信号通路改善脑缺血损伤提供了可靠依据。

脑卒中恢复期病理变化趋于缓和，神经血管再生机制对于促进脑组织修复、改善微循环及神经功能障碍具有重要意义，修复过程中有OPN 的参与［29］。研究表明，黄芪、丹参、三七活性组分可通过上调VEGF、BDNF、SYN 等改善脑缺血再灌注损伤后神经血管重塑，提示神经血管再生及骨桥蛋白相关信号通路可能是芪参益气滴丸改善脑缺血损伤恢复的重要机制［30-32］。

本研究基于网络药理学方法系统分析了益气活血代表方药芪参益气滴丸“多组分-多靶点-多机制”治疗缺血性脑卒中的潜在靶点及机制，为其临床应用提供了理论依据。网络药理学作为一种基于数据库的虚拟模式，不能确切揭示药物在生物体内的作用机制及途经，因此通过网络药理学所得结果尚需进一步验证。