基于网络药理学探讨黄芪治疗缺血性中风的作用机制

唐秀松 陈 静 张青槐 庞宇舟，2

(1 广西中医药大学壮瑶药工程技术研究中心，南宁，530200； 2 中央民族大学民族医药教育部重点实验室，北京，100081)

缺血性中风(Ischemic Stroke，IS)是一种因脑血管闭塞或狭窄,导致局部脑组织缺血缺氧，引起脑组织软化甚至坏死的神经系统疾病[1]。临床表现为偏身麻木、半身不遂、口舌歪斜、吞咽困难等[2]。IS在临床上是常见病、多发病,有“三高”的特点，即发病率高、致残率高、复发率高,严重影响患者的生命质量，给患者和社会带来了极大的经济负担[3]。现代医学治疗IS主要以溶栓、抗凝、抗血小板、调脂稳斑、控制血糖和血压为主[4]。研究表明，中医药治疗IS有一定的优势。

国医大师刘祖贻治疗IS使用黄芪的次数较其他单药多，常用药量为30～60 g，并且丹参-黄芪、黄芪-山楂、葛根-黄芪是高频药对[5]。应用数据挖掘技术，发现王新志治疗IS的883首复方中，黄芪出现311次[6]。黄芪为豆科植物蒙古黄芪[Astragalusmemeranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao]的根，其性微温，味甘，归脾、肺经。具有补气固表、托毒排脓生肌、利尿作用。临床常用于治疗气虚、脱肛、子宫脱垂、汗证、水肿等病症[7]。现代药理研究表明，黄芪含有皂苷类、氨基酸类、黄酮类、生物碱类、等化合物等，具有抗衰老、抗疲劳、抗心力衰竭、抗癌、提高免疫力等作用[8]。

网络药理学是通过借助计算机语言和数据库数据挖掘来构建药物与疾病之间相互作用的网络关系，以进一步阐明药物治疗疾病机制的一门科学。该学科为研究中药治疗疾病的动物实验研究提供了理论依据，为中药现代化研究拓展了方向[9-10]。本研究拟通过网络药理学探讨黄芪治疗IS的作用机制。

1 资料与方法

1.1 黄芪有效成分及相关靶点的收集 在中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)以“黄芪”为关键词进行搜索。其药物有效成分是按照口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18进行过滤筛选，药物相关靶点则不筛选，保存黄芪所有的相关靶点。

1.2 黄芪相关靶点的基因注释 UniProt(https://www.uniprot.org/)数据库又称蛋白质数据库，除蛋白质序列数据外，其中还包含了大量的注释信息。Perl作为一种功能丰富的计算机程序语言，能快速将黄芪的相关靶点在UniProt数据库进行蛋白匹配后获得该蛋白对应的基因，即黄芪的靶点基因。

1.3 IS疾病基因的收集 以“Cerebral Ischemic Stroke”作为关键词，检索人类基因的综合数据库(GeneCards)、在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)中IS相关疾病，整理后去除重复的疾病基因，最终得到IS的疾病基因。

1.4 绘制韦恩图 运用R软件(https://www.r-project.org/)中的VennDiagram程序包对1.2获得的黄芪药物基因和1.3获得的IS疾病基因进行分析处理，最终得到药物与疾病二者的共同基因，即交集基因。

1.5 药物-疾病相互作用网络构建 对1.2获得的黄芪相关基因和1.4获得的黄芪-IS疾病交集基因利用Perl语言进行一一映射，获得相应的网络关系文本文件后运用Cytoscape软件进行网络关系图可视化构建，最终得到中药-有效成分-疾病-基因调控网络。

1.6 药物-疾病蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)网络构建 利用String数据库(https://string-db.org/)导入药物-疾病交集基因，检测条件为种属选择Homo Sapiens，保存PPI网络图。下载并保存PPI网络中的string_interactions.tsv文件。然后运用R软件中的count.R对string_interactions.tsv文件进行分析处理，最终获得PPI网络核心基因的条形图。

1.7 基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 将1.4所得的中药-疾病交集基因利用计算机R软件中的RSQLite程序包、BiocManager程序包、org.Hs.eg.db程序包进行处理，获得交集基因的ID，获得的基因ID后再次运用R软件中的Colorspace程序包、Stringi程序包、DOSE程序包、ClusterProfiler程序包、Pathview程序包进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析。

2 结果

2.1 黄芪药物有效成分筛选和靶点收集结果 在TCMSP数据库中获得黄芪药物有效成分20个，主要包括丁子香萜、熊竹素、常春藤苷皂元、β-谷甾醇、异鼠李素、美迪紫檀素、5′-羟基异氟尿嘧啶-2′，5′-二-O-葡萄糖苷、7-O-甲基异丁香酚、9,10-二甲氧基翼果聚糖-3-O-尾-D-葡萄糖苷、(6aR，11aR)-9,10-二甲氧基-6a，11a-二氢-6H-苯并呋喃[3,2-c]铬-3-醇、联苯双酯、芒柄花黄素、异黄烷酮、毛蕊同黄酮、山柰酚、富马酸、(3R)-3-(2-羟基-3，4-二甲氧基化合物)苯并二氢吡喃-7-ol、异核糖醛-7,2′-二-O-葡萄糖苷、槲皮素等。黄芪相关靶点953个。

2.2 韦恩图绘制结果 通过R软件将180个黄芪药物基因与2 606个IS疾病基因进行计算分析后，提取药物-疾病的共同基因即交集基因，并准确绘制出韦恩图，结果得到137个药物-疾病共同基因。见图1。

图1 药物-疾病韦恩图

2.3 中药-有效成分-疾病-基因网络构建结果 运用Cytoscape软件进行药物-疾病网络构建,拓扑分析结果显示黄芪主要通过16个有效成分作用于137个靶点基因，这137个靶点基因可能影响IS的发生。见图2。

图2 中药-有效成分-疾病-基因网络

2.4 PPI网络构建结果 在String数据库中导入药物-疾病的交集基因，结果显示药物与疾病之间相互作用蛋白包括AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN、MAPK8、PTGS2、CXCL8、EGF、MAPK1、EGFR、MMP9、MYC、FOS、IL1B、ESR1、CCND1、CCL2、MMP2、IL10、RELA、ICAM1、NOS3、PPARG、MAPK14、ERBB2、IL4、HMOX1、SERPINE1、AR等。其中AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN最有可能成为核心蛋白。见图3～4。

2.5 GO富集分析结果 共得到144条GO生物学过程，主要涉及核受体活性、转录因子活性，直接配体调节的序列特异性DNA、细胞因子受体结合、细胞因子受体结合、细胞因子活性、类固醇激素受体磷酸酶结合等。见表1，图5。

图3 药物-疾病PPI网络

图4 药物-疾病核心蛋白条形图

表1 GO生物学过程(Count≥5)

续表1 GO生物学过程(Count≥5)

图5 GO生物学过程条形图

2.6 KEGG通路富集分析 通过R软件计算分析后，共得164条KEGG信号通路，主要包括了AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路、IL-17信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路、乙型肝炎病毒通路、前列腺癌通路、TNF信号通路、人巨细胞病毒感染通路、膀胱癌通路、胰腺癌通路、丙型肝炎通路、内分泌抵抗通路等。其中，按照校正P值，排名前三的是AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路与IL-17信号通路。见图6。

图6A KEGG条形图

图6B AGE-RAGE信号通路

图6C 流体剪切应力与动脉粥样硬化

图6D IL-17信号通路

3 讨论

IS属于中医“中风”的范畴，其基本病机是阴阳失调，气血逆乱。病位在脑，与心、肝、脾、肾密切相关。肝肾阴虚、气衰血少为本，肝阳上亢、风火相煽，瘀血阻滞和痰湿壅滞为标。临床上根据患者的神志是否清醒，将中风分为中经络和中脏腑。其中，补阳还五汤是治疗中经络-气虚血瘀证的经典方，以黄芪四两为该方的主药。

通过KEGG通路富集分析结果发现，富集P值最显著的信号转导通路是AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路与IL-17信号通路。AGE-RAGE信号通路是指晚期糖基化终末产物(Advanced Glycosylation End Products，AGEs)-糖基化终末产物受体(Receptor of AGEs，RAGE)信号通路，AGE-RAGE信号通路具有多种生物学功能，能够激活核因子κB(NF-κB)、转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)的产生、激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶引起氧化应激活性氧等[11]。而据现有资料表明，在中风后活性氧数量显著增加[12]。流体剪切应力与动脉粥样硬化通路与动脉血管的粥样硬化的进展密切相关[13]。IL-17信号通路中，白细胞介素(Interleukin，IL-17)是一个重要的炎症介质，由辅助性T细胞(Th17)及先天性免疫细胞等分泌，在多种炎症反应及自身免疫性疾病病理过程中发挥关键作用，IL-17受体(IL-17R)通过信号转导复合体IL-17R-Act1-TRAF6激活下游核因子κB、JNK等信号通路[14]。研究表明，IL-17/NF-κB p65信号通路在老年急性脑出血发病及组织损伤中具有重要的作用，通过信号转导刺激各种细胞因子的产生，调节老年急性脑出血后炎症反应，缓解急性脑出血后脑组织损伤[15]。

通过中药-有效成分-疾病-基因网络构建，结果发现黄芪抗IS的有效成分有16个，包括山柰酚、槲皮素、异鼠李亭、丁子香萜、熊竹素、常春藤苷皂元、联苯双酯、芒柄花黄素、毛蕊同黄酮等。山柰酚是一种黄酮类化合物，有抗氧化、抗炎、抗癌等多种作用[16-19]。山柰酚可改善脑缺血再灌注大鼠的神经功能症状，减少脑梗死的病理形态学和海马CA1区神经元超微结构,下调Toll样受体4、核因子κB p65、肿瘤坏死因子-α和IL-1β的水平，起到保护神经的作用[20]。山柰酚糖苷可减少核因子κB和STAT3信号表达，抑制缺血再灌注大鼠的神经炎症反应，减小脑梗死面积和神经元、部分细胞(小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞)损伤[21]。槲皮素是黄酮类家族成员之一，具有清除氧自由基、控制血糖、抗动脉粥样硬化、抑制氧化应激反应、减少炎症介质基因表达等作用[22-25]。槲皮素可降低糖尿病合并脑缺血再灌注损伤大鼠的血糖，提高血浆超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活力、降低丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平，改善神经功能评分[26]。槲皮素上调糖尿病脑梗死大鼠的组织型纤溶酶原激活物mRNA表达、减少纤溶酶原激活物抑制物-1 mRNA表达[27-28]。芒柄花黄素属于异黄酮类化合物，有抗炎、抗肿瘤、抗阿尔茨海默病等功效[29-31]。山柰酚与芒柄花黄素能显著改善心肌细胞缺氧状况，缓解心肌受损程度[32]。芒柄花黄素可提高SOD水平、减少MDA水平，改善大鼠脑缺血再灌注后神经功能缺损程度，并能抑制局灶性脑缺血再灌注大鼠Sph K1/S1P信号通路表达[33-34]。

据PPI网络构建结果可知，AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN很有可能成为黄芪抗IS核心基因。蛋白激酶B是一种磷脂酰肌醇-3-激酶下游重要信号分子、信号转导通路中关键的丝氨酸(Ser473)/苏氨酸(Thr308)蛋白激酶[35]，分为蛋白激酶B1、蛋白激酶B2和蛋白激酶B3 3个亚型，其中蛋白激酶B1在大脑分布较多，可加速细胞的增殖[36-37]。羟基红花黄色素A与芍药苷联合用药可上调脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死区磷酸化蛋白激酶B1的表达,能协同保护脑缺血再灌注大鼠的脑损伤[38]。IL6是一种具有多种生物学效应(机体防御、急相反应、免疫反应和造血反应等)的细胞因子，同时也是脑缺血时的一种主要的神经元死亡抑制因子[39]。缺血半暗带中神经元损伤程度与IL-6表达水平正相关[40]。IL-6含量与脑梗死发病后2～3个月MRI测定的脑梗死体积明显相关[41]。血管内皮生长因子A主要参与血管生成[42]。急性脑梗死患者血清中血管内皮生长因子表达水平的上升，与脑梗死疾病严重程度有关[43]。胱天蛋白酶-3是一种蛋白酶，在细胞凋亡中起着关键的作用。败酱总黄酮可减少脑梗死面积，下调脑组织中IL-6、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、胱天蛋白酶-3水平，改善脑缺血再灌注损伤[44]。JUN是1号染色体基因等。抑制c-Jun氨基末端激酶激活能降低大鼠脑缺血再灌注损伤,可能和裂解-胱天蛋白酶-3等表达有关[45]。因此可知，AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN和IS的发生、发展及预后密切相关。

研究发现，癌症代谢调节、病毒应答反应、免疫调节等参与了黄芪治疗IS的信号转导过程。其中AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路是主要信号通路之一。晚期糖基化终末产物受体(Receptor Advanced Glycation End-Products，RAGE)能与AGEs配体特异性结合,下游的核转录因子被激活，提高炎症介质表达,加剧动脉粥样硬化的形成与发展[46]。而动脉粥样硬化正是健康人患IS的高风险因素之一。IL-17属于白细胞介素家族成员之一,是一种前炎症介质及炎症反应调控因子，可诱导多种细胞分泌炎症介质(IL-6、IL-8等),加大炎症反应,加重脑神经细胞的炎症损伤[47]。TNF-α是单核-巨噬细胞分泌的细胞因子，可介导炎症反应的级联激活[48]。TNF信号通路与IS的发病息息相关[49-50]。

综上所述，黄芪是通过16种有效成分作用于137个IS靶点发挥治疗作用，黄芪治疗IS的核心基因的KEGG信号通路主要涉及AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路、IL-17信号通路等164条生物信号转导过程，表明了多个生物学过程的介导和参与是中药发挥治疗作用的关键。本研究为黄芪治疗IS提供了理论依据。