龟甲胶治疗围绝经期失眠症的网络药理学研究

施 敏 刘富林 夏旭婷 张 婷 廖陈敏

(湖南中医药大学，长沙，410208)

围绝经期失眠症是指女性在绝经期前后,伴随烦躁、盗汗等一系列围绝经期综合征出现的以睡眠失常为主的一类症状性疾病，以入睡困难、睡后易醒、醒后难以再次入睡、早醒为主要表现，是围绝经期综合征的主要症状[1]。相关研究表明围绝经期失眠症占围绝经期综合征患者的45%～75%，并有逐年升高趋势[2]。崔亚美等[3]研究表明,围绝经期妇女失眠的发病率为76.8%。围绝经期是女性各个阶段失眠症发病率最高的时期，同时失眠症也是围绝经期所有症状中发病率最高的疾病。近年来，随着大众生活节奏加快，来自社会多方面的压力增大，围绝经期女性失眠症的发病率呈上升趋势，目前针对本病的尚没有较好的治疗方法，药物治疗存在依赖性，也存在不同程度的不良反应，中医通过辨证论治失眠具有独特优势，龟甲胶有滋阴补肾，养血补虚的功效，用于治疗围绝经期失眠症可获良效，本文基于网络药理学分析了龟甲胶治疗围绝经期失眠症的作用机制，希望为龟甲胶治疗围绝经期失眠症的进一步临床应用和实验研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 龟甲胶所含中药活性成分及作用靶基因查询与筛选 借助中药分子机制的生物信息学分析工具(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)以“龟甲”“龟板”为关键词检索龟甲胶所含中药化合物中符合条件的化学成分及相关作用靶基因。筛选人类基因数据库结束后，借助UniProt蛋白质数据库(https://www.uniprot.org/)、NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等对蛋白质靶点进行规范。

1.2 斯坦尼钙调节蛋白(Stanniocalcin，STC)疾病靶基因的筛选 通过人类基因数据库(GeneCards，https://www.genecards.org/)、在线人类孟德尔遗传综合数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://omim.org/)以“Insomnia”为关键词检索围绝经期失眠症的靶基因。

1.3 构建“药物-疾病”交集靶基因数据库 将所筛选的中药活性成分作用靶基因与疾病靶基因的2组数据导入Venny2.1平台获取“药物-疾病”交集靶基因。整合龟甲胶中药、活性成分和围绝经期失眠症靶基因、作用通路之间的作用关系，采用Cytoscape 3.7.2软件进行可视化。

1.4 构建疾病-靶基因-通路-中药网络图 基于龟甲胶药物活性成分与新冠肺炎和消化道疾病靶基因之间相互作用关系，借助Cytoscape 3.7.2软件构建疾病-靶基因-通路-中药网络图。借助CytoNCA插件对中药成分-靶基因网络图进行拓扑分析，在构建关键节点的子网络上以Degree和Betweenness≥2倍中位数为筛选条件，选取满足二者数值的关键节点即为龟甲胶治疗围绝经期失眠症的核心成分。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)的构建及核心基因筛选 将龟甲胶治疗围绝经期失眠症相关的靶基因导入在线String数据库(https://string-db.org/)得到疾病靶基因PPI图，并借助R语言筛选关键节点构建核心网络。将交集基因导入String数据库进行靶基因间的PPI分析，物种选择“人”，置信度设定为大于0.4，得到PPI网络图，其中“边”代表作用靶基因之间的关联，其粗细用combinescore表示，边越粗，combinescore值越大，代表其结合度越大；节点代表作用靶基因。

1.6 核心靶基因的通路分析 基于基因本体(Gene Ontology,GO)数据库与京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)数据库对上述核心靶基因进行基因功能和通路的富集分析，进一步挖掘龟甲胶治疗围绝经期失眠症的关键靶基因及其对应的活性成分和中药，通过评估GO生物过程(Biological Process，BP)、分子功能(Molecular Function，MF)和细胞组分(Cellular Component，CC)等3大模块对基因进行GO富集分析，同时构建可视化的KEGG通路富集分析结果的条形图和气泡图。

2 结果

2.1 中药活性成分及作用靶基因 检索筛选到共6个龟甲胶活性成分天冬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、碳酸钙，活性成分对应的作用靶点共445个，有部分成分作用于相同的疾病靶基因，去重后得到283个作用靶基因。

2.2 STC疾病靶基因 GeneCards数据库检索得到失眠症靶基因2 563个，OMIM数据库检索得到4个，共2 567个。

2.3 “药物-疾病”交集靶基因数据库 交集靶基因21个。见图1。

图1 围绝经期失眠、龟甲胶靶基因韦恩图

2.4 中药成分-靶基因网络图及核心成分 见图2。

图2 龟甲胶-中药成分-通路-疾病靶基因网络

2.5 PPI网络及其核心靶基因 共有21个节点、60条边，平均节点度为5.71，平均局部聚类系数为0.612。采用RX643.6.1软件按Degree值绘制靶基因的柱状图，Degree值排名前10位的核心节点分别为BDNF、TH、ADRB2、DRD2、FOS、SLC6A2、DDC、DRD1、DRD3、NOS1。见图3。

图3 PPI网络(上)、核心基因柱状图(下)

2.6 核心靶基因的通路分析 GO功能富集分析得到条目共1 579个，其中BP、CC、MF条目分别1 456个、33个、90个，研究表明龟甲胶可通过调节多个BP、CC、MF治疗围绝经期失眠症。见表1。

表1 核心靶基因GO富集分析

KEGG通路富集分析筛选得到11条信号通路，可知龟甲胶可通过可卡因成瘾、多巴胺能突触、苯丙胺成瘾、酗酒、cAMP信号通路、酪氨酸代谢、神经活性配体-受体相互作用、松弛素信号通路、组氨酸代谢、TNF信号通路、帕金森综合征作用通路发挥对围绝经期失眠症的治疗作用。见图4。颜色代表富集程度，条形长度、气泡大小代表富集的基因数目。

图4 核心靶基因KEGG富集分析

3 讨论

失眠症属于中医学“不寐”范畴，有“不寐”“目不瞑”“不得眠”“不得卧”“目不瞑”之称，围绝经期失眠症发生于妇女特定生理阶段，与一般内科病所致失眠既有一定的共性，亦有其特点[4]。邵素菊教授认为肝肾阴虚、虚热上扰心神为本病的基本病机，女子七七之年肾精亏损、肾水不能涵养肝木，肝阴不足，虚热上扰心神而发为不寐[5]。目前西医对围绝经期失眠症以药物治疗为主，但易出现药物依赖现象，也存在药物不良反应等。中医药治疗本病，形式多元化，通过滋阴补肾、疏肝养血等治法在改善睡眠、缓解伴随症等方面表现出独特的优势。张喆等[6]通过对180例肝肾阴虚型围绝经期综合征患者进行多中心随机对照研究证明，中医干预能明显改善围绝经期综合征患者的睡眠质量。

现代医学认为围绝经期失眠症的发生与下丘脑-垂体-卵巢轴失衡有关，女性卵巢功能减退、雌激素分泌减少、内分泌失调引起自主神经功能紊乱，最终导致失眠。诸多研究证明睡眠可由雌激素通过中枢神经递质调节控制，失眠可能与雌激素及其受体减少有关[7]。围绝经期失眠症的发病原因尚未明确，目前多认为与雌激素水平下降、围绝经期情绪障碍、5-羟色胺浓度降低、社会心理因素、绝经状态相关。《医效秘传·不得眠》分析失眠病机为阴虚为阳所胜，故以滋阴养血、滋补肝肾之法治疗围绝经期失眠，往往能取得显著疗效。龟甲胶滋阴养血、补益肝肾，应肝脏“体阴而用阳”之性，对阴虚潮热、骨蒸盗汗、腰膝酸软、血虚萎黄等围绝经期综合征有良好疗效，可用以治疗围绝经期失眠症。徐昌万[8]用以龟甲为主要组成的方剂宁心安神汤加减治疗失眠症有效率为96.47%；朱玲[9]通过文献统计分析得出龟甲是治疗围绝经期综合征常用的高频中药，相比于西药，不良反应少且轻微,安全可靠。

本研究通过网络药理学方法对龟甲胶有效成分、作用靶点及通路与围绝经期失眠症的关联及潜在的作用机制进行了初步研究，发现龟甲胶中天冬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸4个化合物作用于围绝经期失眠症相关的BDNF、TH、ADRB2、DRD2、FOS、SLC6A2、DDC、DRD1、DRD3、NOS1等21个靶点，说明了龟甲胶是通过多成分、多靶点协同发挥治疗围绝经期失眠症。

睡眠与觉醒涉及复杂的神经生理过程,研究表明有多种神经递质参与其调控[10]。王桂斌和刘运海[11]通过研究失眠患者多导睡眠图特征发现，睡眠障碍与中枢神经系统内的抑制性氨基酸和兴奋性氨基酸神经递质的动态平衡被打破密切相关；魏文静[12]研究发现许多中枢神经系统疾病与氨基酸类神经递质密切相关。龟甲胶富含多种氨基酸，可平衡中枢神经系统内的氨基酸类神经递质水平从而治疗围绝经期失眠症。

目前有多项临床研究表明脑源性神经营养因子(Brain-derived Neurotrophic Factor，BDNF)可能通过其神经营养功能直接参与睡眠的自我平衡调节过程而干预失眠症状，其作用机制可能与雌激素作用于γ-氨基丁酸能中间神经元，或者与位于BDNF基因上的雌激素反应元件相互作用促进BDNF的表达有关[13-14]。即刻早期基因c-fos为核内蛋白类细胞癌基因，c-fos蛋白参与细胞生长、发育、分化、学习、记忆和信息传递等生理过程，在各种电化学刺激引起的睡眠剥夺里，c-fos基因和蛋白产物可当作是神经细胞被激活的标志以及细胞内信息转导的第三信使进一步作用于基因，最终改变整个神经网络的兴奋性以及神经细胞的固有结构，从而破坏神经网络系统的兴奋-抑制平衡而引起失眠[15]。有实验发现，动眼睡眠剥夺可引起老年大鼠脑皮质和海马区c-fos蛋白表达明显增高[16]。多巴胺水平与失眠症状相关，黄俊山等[17]研究发现血清多巴胺水平高低与失眠症中医虚实证型相关；张华等[18]研究证明多巴胺具有维持觉醒和行为兴奋的作用，其含量的升高可增加觉醒次数，破坏睡眠的完整度。本研究通过分析得出龟甲胶可通过作用于多巴胺D1受体(Dopamine D1 Receptor,DRD1)、DRD2、DRD3基因调控多巴胺的水平从而保证完整的睡眠。

KEGG通路富集分析结果发现，龟甲胶的GO功能富集主要体现在儿茶酚胺代谢、神经递质水平调节、突触传递、多巴胺能、氨基酸结合、神经递质受体活性等。在KEGG通路富集分析中，筛选得到的通路分别为多巴胺能突触、cAMP信号通路、神经活性配体-受体相互作用、TNF信号通路等。肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)是免疫系统重要的细胞因子,除参与炎症反应外,还参与机体睡眠、脑发育、食欲和内分泌等生理功能的调节，脑内TNF的表达受到昼夜节律的影响,动物血中单核细胞产生TNF的能力与睡眠-觉醒周期有关。相关研究发现TNF可延长非快速眼动睡眠时间,说明TNF参与非快速眼动睡眠的调节，其作用机制可能是通过促进脑内5-羟色胺的合成而调节睡眠[19]。有研究表明,睡眠剥夺过程中增加的cAMP可防止因睡眠丧失而导致的记忆巩固不足[20-21]。龟甲胶治疗围绝经期失眠症涉及靶点最多的通路是神经活性配体-受体相互作用通路，该通路包含质膜上所有与细胞内外信号通路相关的受体和配体[22]。龟甲胶可能通过调节上述这些代谢通路而影响中枢神经系统中神经递质的释放及突触传递，最终达到良好的治疗效果。可见，龟甲胶主要以多成分多靶点通过调节多巴胺能系统影响脑内神经递质及其代谢产物含量变化，进而达到睡眠觉醒稳态以发挥治疗失眠的功能。

综上所述，龟甲胶所含的天冬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸等活性成分可能通过儿茶酚胺代谢、神经递质水平调节、突触传递，多巴胺能、氨基酸结合、神经递质受体活性等通路作用于BDNF、TH、ADRB2、DRD2、FOS、SLC6A2、DDC、DRD1、DRD3、NOS1等作用靶点发挥作用，提示龟甲胶可以通过多化合物-多靶点-多通路达到治疗围绝经期失眠症的作用，这体现了中医药“多点显效、协同增效”的特点。