不同温度对苋菜光合特性及光合作用相关基因表达的影响

郑友峰，陈家兰，肖 昉，安子贤，李宜轩，赖钟雄，牟建梅，刘生财，①

(1.福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建 福州 350002；2.苏州市农业科学院，江苏 苏州 215000)

苋菜(AmaranthustricolorLinn.)为苋科(Amaranthaceae)苋属(AmaranthusLinn.)一年生C4草本植物，耐热不耐寒，主要次生代谢产物甜菜色素具有较高的营养价值和药用价值[1，2]。苋菜生长的适宜温度为23 ℃～27 ℃，20 ℃以下生长缓慢，10 ℃以下种子发芽困难[3]。

温度是影响植物生长和次生代谢产物合成的重要因子。低温胁迫使植物基因表达水平和细胞结构改变，物质交换减少，水分代谢失调，叶片萎蔫，严重的可导致植株死亡[4-6]。植物光合作用对温度变化较为敏感，低温导致植物叶绿素合成减少，光合作用受到抑制，从而影响植物生长发育[7，8]。例如：低温胁迫下小麦(TriticumaestivumLinn.)和玉米(ZeamaysLinn.)的叶绿素荧光参数下降，叶绿素含量降低，光合作用减弱[9，10]。高粱〔Sorghumbicolor(Linn.)Moench〕通过光合作用相关基因的下调表达来响应叶绿素荧光参数及叶绿素含量的下降[11]。

目前，关于温度对苋菜影响的研究主要在种子萌发和组培苗生长方面[12，13]，对于温度调控苋菜光合作用的机制尚不明确，研究通过控制温度提高苋菜的光合作用，进而增加苋菜的产量及甜菜色素的含量，对于指导苋菜的栽培和生产具有重要的意义。鉴于此，本试验以苋菜品种‘苏苋1号’(‘Suxian No.1’)为材料，研究不同温度处理对苋菜株高、甜菜色素含量、叶绿素含量、叶绿素荧光参数和光合作用相关基因表达的影响，探究温度调控苋菜光合作用的机制，以期为温度调控苋菜生长提供一定的理论参考。

1 材料和方法

1.1 材料

试验材料为苋菜品种‘苏苋1号’种子，由苏州市农业科学院提供；试验基质为泥炭土，由潍坊达轩商贸有限公司提供。将饱满的种子播撒于直径12 cm的盆中，每盆30粒，共40盆。置于恒温培养室中，光照强度100 μmol·m-2·s-1、光照时间16 h·d-1、温度(25±1)℃，间苗后每盆留7或8株培养至三叶一心。将材料随机分4组，转入不同温度〔25 ℃(对照)、20 ℃、15 ℃、10 ℃〕的恒温光照培养箱中，光照强度100 μmol·m-2·s-1、光照时间16 h·d-1。在不同温度下处理3和6 d后，分为2组。一组进行暗处理，用于叶绿素荧光参数测定；另一组每种处理随机取10株苋菜成熟叶片约5 g，混合后从中取30份，每份0.1 g。取3份叶片用于叶绿素含量测定，其余叶片液氮预冷后放于-80 ℃保存、备用。

1.2 方法

1.2.1 株高的测定 采用直尺(精度0.1 cm)测量苋菜株高(根部至顶端第1枚叶片叶柄间的距离)，每个处理测量30株，结果取平均值。

1.2.2 甜菜色素含量的测定 参照王晓[14]的方法提取甜菜色素，取3份0.1 g苋菜叶片用液氮磨成粉末，按料液比(m∶V)1∶30加入无水乙醇，4 ℃静置30 min，8 000 r·min-1室温离心10 min，弃上清液，再按料液比(m∶V)1∶30加入双蒸水，4 ℃静置30 min，8 000 r·min-1室温离心10 min，取上清液，用UV-900紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)在波长538 nm处测定甜菜红素的吸光值，在波长465 nm处测定甜菜黄素的吸光值，并根据文献[14]中的方法计算甜菜黄素和甜菜红素的含量。

1.2.3 叶绿素含量和叶绿素荧光参数的测定 参考张秀君等[15]的方法提取叶绿素，取3份0.1 g苋菜叶片置于10 mL体积分数95%乙醇中浸泡24 h，取上清液，用UV-900紫外可见分光光度计分别在波长665和649 nm处测定叶绿素的吸光值，并根据文献[15]中的方法计算叶绿素a和叶绿素b的含量。

不同处理的苋菜植株暗处理0.5 h后，每盆选择高度一致、部位相同的苋菜叶片1枚，在黑暗环境下，利用IMAGING-PAM叶绿素荧光成像系统(德国Walz公司)测定苋菜叶片的PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、非调节性能量耗散的量子产量〔Y(NO)〕、PSⅡ实际光量子产额〔Y(Ⅱ)〕、相对电子传递速率(rETR)、非光化学淬灭系数(qN)和调节性能量耗散的量子产量〔Y(NPQ)〕6个叶绿素荧光参数。每个处理3盆(即3次重复)。

1.2.4 qRT-PCR 用天漠植物RNA提取试剂盒(北京天漠科技开发公司)提取叶片RNA；用Hifair®Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR逆转录试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)进行反转录；参照Hieff®qPCR SYBR®Gree Master Mix试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)进行混样。qRT-PCR扩增程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性30 s、59 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s，共45个循环。根据Cp值(crossing point)和溶解曲线检测结果的完整性。

根据苋菜转录组数据库(SRA登录号SSR924089-SSR924092)筛选出参与光合作用的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶(PPCK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、苹果酸脱氢酶(MDH)、NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)、NAD-苹果酸酶(NAD-ME)、NADP-苹果酸酶(NADP-ME)和丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)的基因，通过NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对确定ORF区，用DNAMAN 9.0软件设计引物(表1)，由福州博尚生物技术有限公司合成。

1.3 数据统计和分析

使用EXCEL 2016进行数据统计；根据2-ΔΔCT法[16]计算基因相对表达量；使用SPSS 22.0软件，采用多重比较进行差异显著性分析，并进行Pearson相关性分析；使用Origin 2017软件绘图。

2 结果和分析

2.1 不同温度对苋菜株高的影响

不同温度对苋菜株高的影响见表2。结果显示：处理3和6 d的苋菜株高随着温度降低呈现降低的趋势。处理3 d，15 ℃和10 ℃处理下的苋菜株高均极显著低于25 ℃(对照)；处理6 d，20 ℃、15 ℃和10 ℃处理下的苋菜株高均极显著低于对照。同一处理温度下，处理6 d的苋菜株高均高于处理3 d，但随着温度降低，幼苗生长逐渐受到抑制，10 ℃处理下的苋菜植株已经基本停止生长。

表2 不同温度对苋菜株高的影响

2.2 不同温度对苋菜叶片中甜菜色素含量的影响

不同温度对苋菜叶片中甜菜色素含量的影响见表3。结果显示：处理3和6 d的苋菜叶片中甜菜色素(甜菜红素和甜菜黄素)含量随着温度降低呈现降低的趋势。处理3 d，20 ℃处理下叶片中甜菜黄素含量显著低于25 ℃(对照)，15 ℃和10 ℃处理下叶片中甜菜色素含量均极显著低于对照；处理6 d，20 ℃处理下叶片中甜菜红素含量极显著低于对照，15 ℃和10 ℃处理下叶片中甜菜色素含量均极显著低于对照。随着处理时间的延长，不同温度处理下叶片中甜菜色素含量明显升高。

表3 不同温度对苋菜叶片中甜菜色素含量的影响

2.3 不同温度对苋菜叶片中叶绿素素含量和叶绿素荧光参数的影响

不同温度对苋菜叶片中叶绿素含量的影响见表4，对苋菜叶片叶绿素荧光参数的影响见表5。

结果(表4)显示：处理3和6 d的苋菜叶片中叶绿素(叶绿素a和叶绿素b)含量随着温度降低呈现降低的趋势，且15 ℃和10 ℃处理下叶片中叶绿素含量总体极显著低于25 ℃(对照)。随着处理时间的延长，15 ℃和10 ℃处理下叶片中叶绿素含量明显降低。

表4 不同温度对苋菜叶片叶绿素含量的影响

结果(表5)显示：总体上看，随着温度降低，处理3和6 d的苋菜叶片的PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ实际光量子产额〔Y(Ⅱ)〕、相对电子传递速率(rETR)、非光化学淬灭系数(qN)和调节性能量耗散的量子产量〔Y(NPQ)〕呈现波动降低的趋势，非调节性能量耗散的量子产量〔Y(NO)〕呈现波动升高的趋势，且10 ℃处理下叶片的Fv/Fm、Y(Ⅱ)、rETR、qN和Y(NPQ)值极显著低于对照，Y(NO)值则极显著高于对照。随着处理时间的延长，不同温度处理下叶片的叶绿素荧光参数变化不明显。

表5 不同温度对苋菜叶片叶绿素荧光参数的影响

2.4 不同温度对苋菜叶片光合作用相关基因表达的影响

不同温度对苋菜叶片光合作用相关基因相对表达量的影响见表6。结果显示：总体上看，随着温度降低，处理3 d的苋菜叶片AtrPPCK基因的相对表达量呈现先降低后升高的趋势，AtrPEPC和AtrNADP-MDH基因的相对表达量呈现先升高后降低的趋势，AtrMDH、AtrNAD-ME、AtrNADP-ME和AtrPPDK基因的相对表达量呈现降低的趋势。20 ℃、15 ℃和10 ℃处理下叶片AtrMDH、AtrNAD-ME、AtrNADP-ME和AtrPPDK基因的相对表达量均极显著低于25 ℃(对照)，10 ℃处理下叶片AtrPPCK基因的相对表达量极显著高于对照，10 ℃处理下叶片的AtrPEPC和AtrNADP-MDH基因的相对表达量均极显著低于对照。随着温度降低，处理6 d的苋菜叶片AtrPPCK基因的相对表达量也呈先降低后升高的趋势，AtrPEPC、AtrMDH、AtrNADP-MDH、AtrNAD-ME和AtrPPDK基因的相对表达量呈现先升高后降低的趋势，AtrNADP-ME基因的相对表达量呈现先降低后略有升高的趋势；10 ℃处理下叶片的AtrPPCK基因的相对表达量极显著高于对照，其他5个基因的相对表达量均极显著低于对照。

表6 不同温度对苋菜叶片光合作用相关基因相对表达量的影响

总体上看，6个基因在多数温度下处理3和6 d均与对照有显著差异；温度较低(10 ℃)会抑制除了AtrPPCK基因外的其他基因的表达，随着处理时间延长，基因相对表达量略有回升。

2.5 苋菜各指标与温度的相关性分析

苋菜株高和生理生化指标与温度的相关系数见表7。结果显示：温度与处理3和6 d的株高、甜菜红素含量、甜菜黄素含量、叶绿素a含量和叶绿素b含量以及PSⅡ最大光化学效率均呈极显著正相关，与非调节性能量耗散的量子产额呈显著负相关，与处理3 d的非光化学淬灭系数和调节性能量耗散的量子产额呈极显著正相关，与处理6 d的PSⅡ实际光量子产额和相对电子传递速率呈极显著正相关。

表7 苋菜株高和生理生化指标与温度的相关系数1)

3 讨论和结论

3.1 低温对苋菜生长及甜菜色素含量的影响

设施大棚是保证苋菜进行周年有效生产的主要方式之一，可在一定程度上缓解低温伤害，但也存在不足之处，如没有加温设施的棚室昼夜温差过大，对植物生长有更大伤害，也可能因覆盖棚体影响光照，对苋菜生长产生其他影响[1]。温度作为影响植物生长的重要环境因子，低温环境下植物的生长发育受到抑制，表现出苗弱、生长迟缓、萎蔫皱缩、失绿黄化、产量降低等[17]。如狗牙根〔Cynodondactylon(Linn.)Persoon〕的生长速率随着温度降低呈显著降低的趋势[18]；低温胁迫下苜蓿(MedicagosativaLinn.)幼苗植株较弱，生长缓慢，长期低温甚至会导致幼苗死亡[19]。本研究中，苋菜株高随着温度的降低而降低，在15 ℃和10 ℃处理3 d时受到显著抑制，随着处理时间的延长，20 ℃处理6 d的苋菜生长速度也受到显著抑制，10 ℃处理6 d的苋菜基本停止生长。相关性分析结果显示：株高与温度呈极显著正相关。说明温度较低(15 ℃和10 ℃)会抑制苋菜的生长，长期处于20 ℃时苋菜的生长也会受到抑制。

温度也是影响植物次生代谢的重要因子[20]。苋菜主要次生代谢产物甜菜色素的合成也受到温度的调控，当温度低于20 ℃时甜菜色素的合成受到抑制[21]。本研究结果显示：苋菜叶片中甜菜色素含量随着温度降低而降低，15 ℃和10 ℃处理3 和6 d叶片中甜菜色素含量均极显著低于25 ℃(对照)。相关性分析结果显示：甜菜红素含量和甜菜黄素含量与温度均呈极显著正相关。说明温度较低(15 ℃和10 ℃)会降低苋菜叶片中甜菜色素的含量，15 ℃和10 ℃均不利于甜菜色素的合成与积累。

3.2 低温对苋菜光合作用及相关基因表达的影响

叶绿素是植物叶绿体内参与光合作用的重要色素[22]。低温会破坏叶绿体结构，使叶绿素合成受到抑制，从而影响植物光合作用[23]。如海滨雀稗(PaspalumvaginatumSwartz)在低温胁迫下叶绿素含量明显降低[24]；秋石斛(Dendrobiumspp.)的叶绿素含量随着温度降低和处理时间延长呈现逐渐降低的趋势[25]。本文中，处理3和6 d的苋菜叶片中叶绿素含量均随着温度降低而降低，15 ℃和10 ℃处理下叶片中叶绿素含量均显著低于25 ℃(对照)。相关性分析结果显示：叶绿素a含量和叶绿素b含量与温度均呈极显著正相关。说明温度较低(15 ℃和10 ℃)不利于苋菜叶绿素的合成，降低叶绿素含量，且随着处理时间延长，其对叶绿素含量的抑制效果更明显。

植物叶绿素荧光参数受抑制的程度与环境胁迫的程度呈显著相关，利用叶绿素荧光技术可以检测出叶绿体对温度变化的响应[26]。低温条件下PSⅡ受到抑制，导致植物的PSⅡ光化学效率和电子传输能力降低，并且植物的相对净光合速率(Pn)与PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)和PSⅡ实际光量子产额〔Y(Ⅱ)〕等呈显著正相关[27，28]。在多刺绿绒蒿(MeconopsishorridulaHook.f.et Thoms)和彩叶草〔Coleusscutellarioides(Linn.)Benth.〕的研究中发现，低温下其Fv/Fm值、Y(Ⅱ)值、相对电子传递效率(rETR)显著降低，而qN值随着温度的降低先升高后降低，调节性能量耗散的量子产量〔Y(NPQ)〕和非调节性能量耗散的量子产量〔Y(NO)〕则逐渐升高[29，30]。本研究结果显示:处理3和6 d，20 ℃和15 ℃处理下苋菜叶片的叶绿素荧光参数总体与对照无显著差异，10 ℃处理下叶片的Fv/Fm、Y(Ⅱ)、rETR、qN和Y(NPQ)值总体显著低于对照，仅Y(NO)值显著高于对照。相关性分析结果显示：Y(NO)值与温度呈显著负相关，而Fv/Fm、Y(Ⅱ)、rETR、qN和Y(NPQ)值与温度在不同处理时间呈极显著正相关。说明20 ℃和15 ℃对苋菜的叶绿素荧光参数影响不大，而10 ℃处理会引起苋菜叶绿素荧光参数的显著变化，推测可能是较低温度(10 ℃)下苋菜的叶绿体结构被破坏，叶绿素含量降低，导致光合系统受损[7，31]。

在植物C4光合作用途径中，PPCK先将PEPC去磷酸化，再由PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与CO2反应生成草酰乙酸(OAA)，经MDH和NADP-MDH将草酰乙酸催化生成苹果酸，然后由NAD(P)-ME催化苹果酸生成丙酮酸，再由PPDK将丙酮酸催化重新形成CO2受体PEP[32-36]。光合作用途径中酶的活性极易受到温度的影响，如水稻(OryzasativaLinn.)[37，38]、甘蔗(SaccharumofficinarumLinn.)[39]、拟南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.)Heynh.〕[40]和柳枝稷(PanicumvirgatumLinn.)[41]的光合作用酶活性在低温下显著下降。处理3和6 d，苋菜光合作用相关基因的表达也受到温度的调控。qRT-PCR结果显示：不同温度处理下苋菜AtrPPCK、AtrPEPC、AtrMDH、AtrNADP-MDH、AtrNAD-ME、AtrNADP-ME和AtrPPDK基因的相对表达量总体与对照存在显著差异，并且较低温度(10 ℃)抑制除了AtrPPCK基因外其他基因的表达。此外，随着温度的降低AtrPPCK基因的相对表达量先降低后升高，而AtrPEPC基因的相对表达量则先升高后降低。推测随着温度的降低，苋菜在20 ℃和15 ℃条件下AtrPPCK基因的表达受到抑制，对PEPC的去磷酸化作用减弱，使得AtrPEPC基因上调表达；而在10 ℃环境下AtrPPCK基因的表达增加，提高了对PEPC的去磷酸化作用，AtrPEPC基因的表达受到抑制[42,43]。因此，温度通过影响PPCK对PEPC的去磷酸化作用，可作为温度调控植物光合作用的方式之一。

综上所述，低温可能通过降低苋菜的叶绿素含量，破坏光合系统，抑制光合作用相关基因的表达，从而降低苋菜主要次生代谢产物甜菜色素的积累，最后导致植株的生长受到抑制。由于众多的代谢通路参与到苋菜的光合作用途径，因此，对于低温引起光合作用基因差异表达的调控机制还有待深入了解，基因功能还需进一步验证。