3种金银花提取物抗细菌内毒素的作用研究

任 涛 庞玉莲 薛诗夏 陈 旭 张雨涵 杨 剑 谭艾娟 吕世明*

（1贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；2贵州大学生命科学学院，贵州贵阳 550025）

细菌性腹泻是人和动物的常见疾病，细菌毒素引起的剧烈腹泻、多器官损伤和脱水是细菌性腹泻的主要危害[1]。目前，临床主要通过抗菌、支持疗法治疗细菌性腹泻，但抗菌药物治疗在杀死细菌的同时也可造成细菌内毒素突击释放而危及生命[2]。革兰氏阴性细菌在死亡后释放的内毒素为细菌细胞壁的脂多糖成分，过多的细菌内毒素可在动物机体内发生一系列严重的病理反应。因此，在探索抗菌治疗的同时降低细菌毒素危害的途径，对安全、有效地指导治疗细菌性腹泻具有重要意义，目前对这方面的研究鲜有报道。

金银花是重要的中药材，其具有良好的抗炎[3-7]、抗菌[8-11]、抗病毒[12-16]等作用。已有研究表明，金银花能减轻腹泻时细菌毒素导致的危害[17]。在前人研究报道中发现，金银花的体外抑菌活性较好，但是目前对金银花体外抗细菌内毒素的研究较少。基于此，本试验拟研究金银花不同提取物如水提取物、醇提取物、石油醚提取物等的体外抗细菌内毒素作用，以期为后续金银花抗细菌内毒素的作用机制研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 材料。供试材料有：金银花干花，购自北京同仁堂（安国）中药饮片有限公司；乙酸乙酯、石油醚、无水乙醇、浓盐酸、醋酸，均为国产分析纯；显色基质鲎试剂（end-point chromogenic tachypleus amebocyte lysate，EC TAL），购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司。

1.1.2 仪器。供试仪器包含旋涡混合器（济南欧莱博科学仪器有限公司）、LDZM-60KCS立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、FA2004型电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）、分光光度计（南京菲勒仪器有限公司）、旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、250 mL玻璃蛇形索氏提取器（崇州市蜀玻科学仪器有限责任公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 金银花提取液的制备。分别采用水提法、乙醇回流提取法和石油醚回流提取法制备金银花的提取液。

（1）水提法。将金银花干花粉碎制成细粉，取10 g金银花细粉溶于160 mL蒸馏水中，提取温度为80℃，煎煮1次用时1.5 h。得到的水提物经纱布过滤4次，然后抽滤1 h，再经转速10 000 r/min离心8 min取上清液，得到水提取物。

（2）乙醇回流提取法。准确称取10 g金银花细粉并用滤纸封闭，加入160 mL 75%乙醇中，提取温度为95℃，回流2次，用时200 min。将提取液抽滤10 min，在95℃条件下分馏出无水乙醇回收处理，再经转速10 000 r/min离心8 min，取上清液，获得乙醇提取物。

（3）石油醚回流提取法。精确称取金银花干花10 g加入160 mL石油醚，50℃回流提取2次，用时1 h。再将提取液在52℃下分馏出石油醚进行回收，再用无水乙醇稀释，经转速10 000 r/min离心8 min取上清液，得到石油醚提取物。

1.2.2 测定内容与方法。金银花中对细菌内毒素清除效果最佳的主要有效成分为绿原酸。本试验先制作绿原酸标准曲线，再对其含量进行测定。

（1）绿原酸标准曲线制作。参考李 坤等[18]、李耀仓等[19]文献报道进行绿原酸标准曲线的制作：称取1.0 mg绿原酸标准品与无水乙醇置于10 mL容量瓶中并摇匀，再从中分别吸取 500、1 000、1 500、2 000、3 000 μL于另一10 mL容量瓶中，再用无水乙醇对绿原酸进行定容。将不同浓度的绿原酸溶液分别装入干净的试管中并编号。调至绿原酸最大吸收波长328 nm处测量吸光度，以5个不同浓度样本的吸光度值为纵坐标、以绿原酸标准品溶液的浓度（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线。

（2）绿原酸含量测定。取醇提法获得的提取液1.5 mL（其对细菌内毒素的清除率最高），加入蒸馏水40 mL进行稀释后，采用紫外分光光度法对其吸光度值（OD328）进行测定，并记录数值。根据绿原酸标准曲线方程，得出金银花醇提物中主要有效成分绿原酸的含量。

1.2.3 金银花提取物与细菌内毒素的作用。分别取0.75 mL不同方法提取的金银花提取液与0.75 mL细菌内毒素标准品（5 EU/mL）进行混合后，放置于37℃温育12 h，使3种金银花提取物与细菌内毒素发生作用，取出备用。

1.2.4 鲎试验（终点显色法）检测内毒素清除效果。以标准曲线为基础，通过鲎试验测定不同金银花提取物对内毒素的清除作用。

（1）标准曲线的建立。以15 EU/mL的内毒素标准溶液为母液，用细菌检查用水将其稀释成0.10、0.25、0.5、1.0 EU/mL的浓度梯度。取无热原试管，加入100 μL细菌内毒素检查用水、设计好的内毒素标准溶液和供试品。再加入100 μL鲎试剂溶液，混匀后盖上试管盖，37℃温育6 min。温育结束后再加入100 μL显色基质溶液，混匀，37℃温育6 min。温育结束后向其加入500 μL偶氮化试剂1溶液，混匀；再加入500 μL偶氮化试剂2溶液，混匀；最后加入500 μL偶氮化试剂3溶液，混匀后静置5 min。将分光光度计调至545 nm波长处读取待测样本的吸光度值。以吸光度值作为纵坐标、细菌内毒素浓度作为横坐标建立内毒素标准曲线。

（2）鲎试验测定不同金银花提取物对内毒素的清除作用。3种提取方法所得到的金银花提取液与细菌内毒素作用后，参照鲎试剂说明书，通过鲎试剂、显色基质反应和偶氮化试剂的颜色反应，测定水提取法、乙醇提取法、石油醚提取法所得提取物中内毒素的残留含量。根据以下公式得出3种提取物对内毒素的清除率[20]。

2 结果与分析

2.1 不同金银花提取物中绿原酸含量的测定结果

以绿原酸标准品溶液的吸光值为纵坐标、绿原酸标准品溶液的浓度（μg/mL）为横坐标制作出标准曲线，如图1所示。该曲线的回归方程为y=0.032 5x-0.011 6，R2=0.999 8。

不同金银花提取液中绿原酸的浓度如表1所示，金银花水提取液、乙醇提取液、石油醚提取液中绿原酸含量分别为 11.536±0.036、12.347±0.099、11.752±0.047 μg/mL。结果表明，3种提取液中，乙醇提取液中绿原酸含量极显著高于水提取液和石油醚提取液中绿原酸含量。

表1 不同金银花提取物中绿原酸含量（n=3）

2.2 不同金银花提取物对细菌内毒素的清除率

以细菌内毒素标准溶液的吸光度值作为纵坐标、细菌内毒素标准溶液的浓度作为横坐标，建立细菌内毒素标准溶液的标准曲线，如图3所示。标准曲线的回归方程为y=0.88x+0.103 4，R2=0.998 3。测得阴性对照组吸光度平均值y=0.056，低于标准曲线最低点的y值，满足试剂盒测定要求；同时，对供试品进行干扰试验，测得供试品的回收率为98%，符合试剂盒说明书中50%～200%的要求，因而在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。

3种提取方法得到的金银花提取液与标准细菌内毒素作用后，进行显色基质反应和偶氮化试剂的颜色反应。将水提取法、乙醇提取法、石油醚提取法提取物的吸光值代入回归方程（y=0.88x+0.103 4），计算出3种提取液中内毒素残留量。结果表明，水提取液、乙醇提取液、石油醚提取液中内毒素残留量分别为 0.799±0.005、0.164±0.001、0.175±0.002 EU/mL。根据清除率方程计算，水提取液对细菌内毒素的清除率为84.02%±0.10%，乙醇提取液对细菌内毒素的清除率为96.71%±0.02%，石油醚提取液对细菌内毒素的清除率为96.50%±0.04%（表2）。

表2 不同金银花提取物对细菌内毒素的清除作用（n=4）

3 结论与讨论

细菌性腹泻危及人和动物的健康，导致剧烈腹泻、多器官损伤和脱水。虽然可以通过抗菌药物进行治疗，但伴随抗菌药物在临床上长期的广泛使用，各种类型的耐药菌株也相继产生。抗菌药物在发挥治疗作用而杀死细菌的同时，也会造成细菌内毒素突然释放，可能对人和动物生命造成威胁[21]。在抗菌治疗时降低细菌毒素的危害，对安全、有效地指导治疗细菌性腹泻具有重要意义。

本试验采用水提法、乙醇回流提取法、石油醚提取法得到3种金银花提取物，测得绿原酸含量分别为 11.536±0.036、12.347±0.099、11.752±0.047 μg/mL。将3种金银花提取物与5 EU/mL的标准大肠杆菌内毒素作用12 h，通过鲎试验测定各提取物中残留内毒素的含量。结果发现，水提取法、乙醇提取法、石油醚提取法所得提取物中残留内毒素的含量分别为0.799±0.005、0.164±0.001、0.175±0.002 EU/mL。 水提取液对细菌内毒素的清除率为84.02%±0.10%，乙醇提取液对细菌内毒素的清除率为96.71%±0.02%，石油醚提液对细菌内毒素的清除率为96.50%±0.04%。由此表明，乙醇提取液对大肠杆菌内毒素的清除作用最佳，其次为石油醚提取液和水提取液。

研究指出，金银花水提物能够破坏细菌内毒素的结构，从而起到抗炎作用；其中绿原酸为金银花中主要抗菌成分，其对细菌内毒素也有一定的对抗作用[22]。本试验采用鲎试验法筛选出的金银花乙醇提取物对细菌内毒素清除效果最佳，并且乙醇提取物中绿原酸含量最高，这说明金银花中主要成分之一的绿原酸可能在细菌内毒素清除方面发挥重要作用。

综上所述，金银花乙醇提取液对大肠杆菌内毒素的清除效果最佳，其清除作用可能与金银花乙醇提取物中较高的绿原酸含量有关，具体机制需进一步研究。