一株生防菌的筛选及其抗菌活性研究

顾会战 史洪涛 何佶弦 母明新 尹振华 孙会忠 王小东*

（1四川省烟草公司广元市公司，四川广元 628100；2河南科技大学农学院，河南洛阳 471003）

对于植物而言，根际环境生活的大量微生物群落通过代谢活动对植物汲取养分、生长发育、病虫害防御等起到很好的促进作用[1-4]。从根际环境中分离出的特定功能菌在与附生植物长期协同进化的过程中形成稳定的共生关系，往往能够产生特定的生物活性物质，从而表现出特定的功能活性，这是从特定环境筛选微生物资源（包括生防菌）的理论依据之一[5]。

烟草根际环境中存在丰富的微生物种群，包括细菌、真菌、放线菌、微藻、单细胞的原生动物等[6-7]，从烟草根际环境中筛选出生防细菌理论上是可行的，且从烟草根际环境筛选出来的生防菌对烟草具有更好的亲和性，有利于对烟草真菌病害的防治。在此背景下，本研究对烟草根际土壤细菌进行了分离培养，筛选鉴定了具有显著抑菌活性的微生物，并通过盆栽试验验证筛选菌株的生防效果，最后对目标菌株进行了分类鉴定。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试土样。采集烟草根际土壤，称量1 g土样加入锥形瓶内，加入10 mL无菌水，摇床振荡10 min充分混匀后即制得10-1土壤悬浮液。另取添加9 mL无菌水的试管，取10-1土壤悬浮液1 mL加入试管并振荡摇匀，用同样方法依次往复，制成10-4、10-5、10-6等3个浓度梯度的土壤悬浮液，各吸取1 mL涂板，37℃恒温培养48 h。

1.1.2 供试培养基。①NA固体培养基，供内生细菌的分离、培养及拮抗试验用。②PDA培养基，供病原真菌的培养及拮抗试验用。③LB液体培养基，供生防菌菌悬液制备用。

1.2 抑菌活性测定

1.2.1 菌悬液的制备。将纯化细菌接入100 mL的LB液体培养基中，然后在32℃、200 r/min条件下培养24 h。取适量菌液于灭菌离心管中，12 000 r/min离心15 min，收集菌体，用无菌水悬浮并调整浓度至1.0×108CFU/mL，获得菌株菌悬液。

1.2.2 平板对峙试验。采用牛津杯平板对峙法，分别考察分离内生细菌对指示病原真菌黑曲霉的拮抗作用。在PDA平板中央接入黑曲霉菌饼，距菌饼一定距离对称放置2个牛津杯，且每个牛津杯加注20 μL制备好的内生细菌菌悬液，以牛津杯注入无菌水作为对照，3次重复，置于28℃的培养箱中连续培养5～7 d，定期观察生长情况。对照组长满整个培养皿的3/4时，计算抑菌率，计算公式如下：

抑菌率（%）=（对照菌落直径－处理菌落直径）/对照菌落直径×100

1.3 目标菌抑菌作用应用实测试验

测试植株的制备：用PDA培养基培养烟草白粉病病原，并制备孢子悬浮液（血球计数板检测孢子数目，调整孢子浓度至1.0×105CFU/L）。侵染方法：取1 mL孢子悬浮液接种到植株根部，同时进行叶面喷雾，确保植株发病；以无菌水处理作对照。

将抑菌效果最好的菌株用LB液体培养基32℃摇床培养至OD=4，然后12 000 r/min离心15 min收集菌体，再用等量无菌水悬浮菌体制得测试母液。施用方法为喷雾法（叶片完全湿润）和灌根法，施用时间为病原侵染2 d后。每个处理3次重复，以无菌水处理作对照，7 d后进行叶片病情指数及发病率调查。

烟草白粉病调查分级标准：0级，叶部无病斑出现；1级，病斑面积占叶片总面积的15%以下；2级，病斑面积占叶片总面积的15%～25%；3级，病斑面积占叶片总面积的25%～50%；4级，病斑面积占叶片总面积的50%以上。

病情指数=Σ（各级病叶数×相对级数值）/（调查总叶片数×最高级数值）×100；

防治效果（%）=（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数×100。

1.4 菌株的多相分类鉴定

1.4.1 形态学观察及生理生化特征测定。将测定菌株接种于LB固体培养基培养48 h，制样进行光镜和扫描电镜下的形态观察[8]。生理生化指标的测定方法参考文献[9-10]。

1.4.2 菌株16S rDNA分析。将测定菌株接种于LB固体培养基，摇床过夜培养，采用试剂盒提取基因组DNA；选用通用引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR体系及操作方法参考文献进行。测序结果提交NCBI进行比对，并采用MEGA7的N-J法构建系统发育树[11]。

2 结果与分析

2.1 根际土壤细菌分离结果

土壤悬浮液涂布NA平板中，37℃培养2～3 d以后，平板上形成特征菌落。挑取菌落进行3次划线纯化，获得19株细菌活体纯培养物，编号为GHZ1～GHZ19。采用15%甘油于-20℃条件下保种备用。

2.2 生防活性菌株评估结果

以黑曲霉为指示菌株，分别对获得的19株根际土壤细菌的拮抗活性进行测定，对峙试验结果表明，GHZ05、GHZ09和GHZ12等3株菌对黑曲霉具有显著的抑制作用，抑菌圈直径依次为13、11、28 mm，抑菌率依次为 31.36%、40.55%、60.39%（图1）。

2.3 菌株GHZ12的生防应用效果

盆栽试验验证了菌株GHZ12对烟草白粉病的生物防治效果。烟草白粉病病原侵染接种6 d后植株开始发病，初期表现为叶片正面出现黄褐色褪绿小斑，随即在斑块的正反两面出现毯状小点，渐次扩大，白粉可覆盖叶片的大部或全部，严重时叶片干枯，后期偶尔可见黑色的颗粒体。由表1可知，GHZ12菌悬液的灌根、叶面喷雾和灌根+叶面喷雾3种不同处理表现出不同的生防效果，灌根+叶面喷雾混合处理在整个发病期均表现出比叶面喷雾和灌根单一处理要好的生防效果。15 d时，灌根+叶面喷雾混合处理的防治效果达到了56.50%，叶面喷雾防治效果为59.96%，2个处理的防治效果均为单一灌根处理的2倍以上。3种施用方法防治效果相互之间差异达显著水平。验证结果证实，GHZ12菌株对烟草白粉病的防治是有效的，在施用方法上，单一叶面喷雾和灌根+叶面喷雾均取得了较好的生防效果；灌根效果较差，不宜单独使用。

表1 菌株GHZ12对烟草白粉病的防治效果

2.4 菌株GHZ12的分类鉴定结果

菌株GHZ12的形态特征（图2）：菌落呈土黄色，不透明，边缘具有齿状突出，菌落整体隆起明显，表面半湿润。革兰氏染色阴性，菌体杆形，多单生，两端钝圆，具有端鞭毛，长 1.3～2.2 μm，直径 0.5～0.9 μm。

菌株GHZ12的生理生化指标测定结果呈阳性反应的项目包括明胶水解试验、V-P试验、柠檬酸盐利用试验、接触酶试验、脲酶水解试验和吲哚试验；阴性反应项目包括淀粉水解、甲基红试验、糖类（葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖）发酵试验。

菌株GHZ12的16S rDNA基因扩增产物测序结果为1 496 bp，序列在GenBank比对获得同源性较高的序列，并构建进化树（图3）。结果表明，菌株GHZ12与Pseudomonas sp.S35（KT890311.1）聚在同一分支。结合菌株LZ-7的形态、生理生化和分子鉴定结果，将其鉴定为假单胞菌属菌株，暂命名为Pseudomonas sp.GHZ12。

3 讨论

烟草是我国重要的经济作物，在栽培过程中病害严重，通过寻找生防菌能够实现烟草病害的绿色防控，这也是烟草行业可持续发展的技术需求[12]。本研究从烟草根际土壤中共分离出3株拮抗菌株，试验以黑曲霉为指示菌株，3株具有拮抗活性的菌株GHZ05、GHZ09和GHZ12可初步定性为对真菌病原具有抑制作用的生防菌，具有后期深度开发的价值。

盆栽试验证实，GHZ12对烟草白粉病具有较好的生防效果，从第5天发病开始到第15天的发病周期中，GHZ12的生防效果在各处理中均持续提高，这说明GHZ12发挥出了对烟草白粉病病原持续性的抑制作用，符合生防菌发挥作用的规律和生物学特点，可作为开发烟草白粉病生物防治的资源菌株。