LncRNA PVT1/miR-124轴靶向Jagged-1/Notch通路抑制晶状体纤维化的分子机制研究

汪 涛，张振华，陈文兵，刘建军，张彩霞，吕嘉华

(1.南京医科大学附属苏州科技城医院眼科，江苏 苏州 215153；2.苏州眼耳鼻喉科医院眼科，江苏 苏州 215006；3.苏州大学附属第一医院眼科，江苏 苏州 215006；4.上海复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科，上海 200031)

纤维化是一种慢性多器官疾病，其主要病变基础为病理性上皮—间充质转化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)[1]。晶状体纤维性疾病，如前囊下白内障(anterior subcapsular cataract，ASC)和后囊膜混浊(posterior caular opacification，PCO)，是视力障碍的常见原因[2-3]，其细胞学机制都与晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LECs)EMT有关，转化生长因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)诱导的LECsEMT被认为是构建晶状体纤维性疾病体外模型的有效途径，这为我们开展相关研究提供了方便的实验模型[4]。据报道，众多非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)在调节EMT过程中发挥关键作用[5-7]。深入探索基因调控网络，如LncRNAs/miRNAs/mRNAs，有助于了解晶状体纤维化的进展机制。本研究结合ASC患者的晶状体前囊膜组织转录组学数据，筛选差异性表达最典型的LncRNA PVT1，探究其在LECs纤维化和白内障进展中的作用及潜在分子机制，以期证实针对LncRNA PVT1/miR-124/Jagged-1/Notch通路的药物靶向在预防和治疗ASC、PCO或其他器官纤维化方面的价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床标本采集 共收集了18例捐赠者(年龄40～58岁，男性15例，女性3例)的新鲜晶状体标本，其中9例来自白内障手术患者(ASC患者，晶状体混浊度LOCSⅢ分级4～6级，排除糖尿病葡萄膜炎病史者)，术中取出晶状体囊膜后，用撕囊钳分离前囊纤维化组织部分；另9例正常透明晶状体组织来自健康人体的死后捐赠眼(在死后8 h内获得，排除眼部疾病，LOCSⅢ分级1～2级)，采用撕囊钳沿晶状体赤道区切开晶状体前囊膜，取晶状体上皮组织。将晶状体上皮组织块置于含体积分数1%胎牛血清、体积分数1%非必需氨基酸、100 IU·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素的DMEM培养基中，培养上皮侧面朝上。本研究获南京医科大学附属苏州科技城医院医学伦理委员会批准(2020021)，所有实验及样本采集符合《赫尔辛基宣言》。

1.1.2 细胞、主要药物与试剂 人晶状体上皮细胞株SRA01/04(中国医学科学院肿瘤研究所协和医院)。TGFβ2、特异性Notch受体裂解抑制剂同义γ-分泌酶抑制剂Ⅸ(γ-Secretase Inhibitor Ⅸ，GSI-Ⅸ)、TGF-β/Smad抑制剂SB431542(美国Sigma-Aldrich公司)；miRNeasy Mini试剂盒(德国Qiagen公司)。GenePORTER转染试剂(美国Genlantis公司)；pcDNA3.1质粒(美国Invitrogen公司)；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒、PrimeScript RT Master Mix试剂盒、SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)。初级抗体：纤维蛋白(fibronectin，FN)、Ⅳ型胶原蛋白(collagen type Ⅳ，Col Ⅳ)、钙黏附蛋白E(E-cadherin)、钙黏附蛋白N(N-cadherin)、肌动蛋白α(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3、Snail、Slug(美国Cell Signaling Technology公司)。EZ-Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒(美国Millipore公司)。

1.1.3 主要仪器 ND-1000紫外分光光度计(美国NanoDrop Technologies公司)；LSM510激光扫描共聚焦显微镜(德国ZEISS公司)；LightCycler 480II实时PCR系统(瑞士Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染及分组 将SRA01/04细胞培养于DMEM完全培养基(含体积分数1%胎牛血清、体积分数1%非必需氨基酸、100 IU·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素)中。为了研究下调LncRNA-PVT1表达对EMT及下游通路的影响，将SRA01/04细胞分为空白组、TGFβ2组、si-control组、si-PVT1组、si-PVT1+miR-NC组、si-PVT1+miR-124-inhibitor组。空白组细胞不作任何特殊处理。TGFβ2组用5 ng·mL-1TGFβ2作用48 h，si-control组、si-PVT1组、si-PVT1+miR-NC组、si-PVT1+miR-124-inhibitor组分别转染PVT1小分子干扰RNA(siRNAs)的阴性对照序列、si-PVT1-1/si-PVT1-2、si-PVT1+miR-124 inhibitor阴性对照序列或miR-124 inhibitor序列后，用5 ng·mL-1TGFβ2作用48 h。为了研究TGFβ2对LncRNA PVT1表达的影响，将SRA01/04细胞分为空白组、TGFβ2组、GSI-Ⅸ+TGFβ2组和SB431542+TGFβ2组。GSI-Ⅸ+TGFβ2组和SB431542+TGFβ2组分别在TGFβ2作用前60 min加入GSI-Ⅸ(10 μmol·L-1)或SB431542(10 μmol·L-1)。

1.2.2 微阵列分析 使用TRIzol试剂和miRNeasy Mini试剂盒提取组织或细胞总RNA(每3份RNA合并成1份样本)。利用紫外分光光度计检测RNA样本的质量和纯度，通过凝胶电泳测定RNA完整性。利用Agilent Array平台进行微阵列分析，分别以健康眼和ASC眼、TGFβ2组和未经TGFβ2处理的空白组SRA01/04细胞LncRNAs差异表达为目标。从总RNA中去除rRNA后提纯mRNA，然后采用随机引物法扩增样本，并沿着整个转录本长度转录成荧光cRNA。将标记的cRNAs与Arraystar人LncRNA微阵列v3.0杂交。利用Agilent G2505C扫描仪扫描和特征提取软件v11.0.1.1对采集的阵列图像进行分析，用GeneSpring GX v11.5.1软件对微阵列数据进行生物信息学分析和可视化处理。

1.2.3 实时荧光定量PCR法检测基因表达 利用TRIzol试剂提取SRA01/04细胞总RNA，使用DNase I酶提纯基因组DNA。合成cDNA，并在ABI Prism7000热循环仪上进行实时PCR反应。循环条件为：50 ℃ 2 min；95 ℃ 5 min；然后在95 ℃ 10 s和60 ℃ 45 s下进行40次循环。采用RNU6B和GAPDH作为内参。

1.2.4 Western blot法检测蛋白表达 用100 μL裂解液提取细胞总蛋白，经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，半干法电印迹到聚偏氟乙烯膜上。用体积分数5%的脱脂牛奶封闭细胞膜，并与不同的一抗(Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3、Snail、Slug、FN、Col Ⅳ、E-cadherin、N-cadherin、α-SMA)在4 ℃下孵育过夜。然后在室温下与辣根过氧化物酶藕联的二抗孵育1 h。

1.2.5 双荧光素酶报告基因分析 利用两种靶向识别工具Pictar(http://pictar.mdc-berlin.de/)和TargetScan 4.2(http://www.targetscan.org/vert_42/)来寻找LncRNA PVT1和miR-124的潜在靶基因。用PCR法扩增含有预测miR-124结合位点或相应突变位点的Jagged-1和LncRNA PVT1的3’-UTR序列，并转染至pMIR-RB-REPORT荧光素酶编码区。在转染前24 h先将293T细胞接种于96孔板中。次日用LipofectamineTM2000转染试剂将100 ng·mL-1报告质粒和50 nmol·L-1的miR-124 mimics或对照序列共转染至293T细胞，用双荧光素酶检测系统检测荧光素酶活性。

1.2.6 RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation，RIP)法分析 裂解1×107个细胞，将100 μL细胞裂解混合物与含有抗Ago2结合磁珠的RIP缓冲液共孵育。用蛋白酶K缓冲液消化样本，分离免疫沉淀RNA。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 微阵列分析LncRNAs差异表达谱

利用人LncRNA微阵列分析，热图显示健康眼、ASC眼前囊膜组织存在628个差异性表达的LncRNAs(变化倍数≥2.0，P<0.05)，其中287个LncRNAs表达上调，341个LncRNAs表达下调，其中PVT1上调最明显(图1a)。此外，在LECs样本中，空白组、TGFβ2组存在371个差异性表达的LncRNAs(变化倍数≥2.0，P<0.05)，其中171个LncRNAs表达上调，200个LncRNAs表达下调，PVT1是上调最明显(前五位)的LncRNAs之一(图1b)。

a：健康眼和ASC眼差异性表达的聚类分析热图和火山图；b：空白组和TGFβ2组SAR01/04细胞差异性表达的聚类分析热图和火山图

2.2 实时荧光定量PCR法检测前囊膜组织和细胞中LncRNA PVT1、miR-124 mRNA表达水平

ASC眼的前囊膜组织和TGFβ2组SAR01/04细胞中LncRNA PVT1 mRNA表达水平较健康眼或空白组细胞升高(P<0.05)，同时miR-124 mRNA表达水平降低(P<0.05)。经Spearman秩相关系数分析，在ASC眼的前囊膜组织或TGFβ2组SRA01/04细胞中LncRNA PVT1与miR-124表达水平均呈负相关性(P<0.05)。此外，分别用1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1TGFβ2作用于细胞48 h，LncRNA PVT1 mRNA表达水平逐渐升高(P<0.05)；用5 ng·mL-1TGFβ2分别作用于细胞12 h、24 h、48 h，LncRNA PVT1 mRNA表达水平亦逐渐升高(P<0.05)，说明TGFβ2可显著诱导SRA01/04细胞LncRNA PVT1过表达，且呈剂量依赖性和时间依赖性，见图2。

a：前囊膜组织LncRNA PVT1 mRNA表达差异(n=9)；b：前囊膜组织miR-124 mRNA表达差异(n=9)；c：SRA1/04细胞中LncRNA PVT1 mRNA表达差异(n=8)；d：SRA1/04细胞中miR-124 mRNA表达差异(n=8)；e：前囊膜组织LncRNA PVT1 mRNA和miR-124 mRNA表达的关系；f：SRA1/04细胞LncRNA PVT1 mRNA和miR-124 mRNA表达的关系；g:不同浓度TGFβ2作用于SRA1/04细胞48 h；h:不同时间5 ng·mL-1 TGFβ2作用于SRA1/04细胞 *：P<0.05

2.3 Western blot法检测SRA01/04细胞EMT标记蛋白表达

与空白组相比，TGFβ2组上皮分化标志物E-cadherin蛋白表达下调，同时间充质细胞标志物FN蛋白表达上调(P<0.05)。然而分别转染si-PVT1-1和si-PVT1-2后，E-cadherin蛋白表达高于TGFβ2组和si-control组，同时FN蛋白表达低于TGFβ2组和si-control组，尤其以si-PVT1-2组变化最明显(P<0.05)，见图3a。故选择转染si-PVT1-2用于后续实验。此外，与空白组相比，TGFβ2组和si-control组间充质细胞标志物FN、α-SMA、Col IV、Snail、Slug蛋白表达上调，而si-PVT1组和si-PVT1+miR-NC组上述蛋白表达低于TGFβ2组和si-control组，但si-PVT1+miR-124-inhibitor组可逆转si-PVT1对上述蛋白表达的下调作用(P<0.05)，见图3b。

a：FN、E-cadherin蛋白表达；b：FN、α-SMA、Col Ⅳ、Snal、Slug蛋白表达 *：与空白组相比，P<0.05；#：与TGFβ2组相比，P<0.05；△：与si-control组相比，P<0.05；▲：与si-PVT1组相比，P<0.05；□：与si-PVT1+miR-NC组相比，P<0.05

2.4 双荧光素酶报告基因验证LncRNA PVT1、miR-124、Jagged-1之间的靶向作用

与转染miR-NC相比，转染miR-124 mimics能显著降低PVT1、Jagged-1野生型(位点1、位点2)的荧光素酶活性(P<0.05)，见图4。

a：LncRNA PVT1与miR-124靶向结合关系；b：Jagged1与miR-124靶向结合关系 *：与miR-NC相比，P<0.05

2.5 RIP法分析LncRNA PVT1和miR-124的调控关系

结果证实，LncRNA PVT1和miR-124都特异性富集了Ago2抗体相关复合物(P<0.05)，见图5，表明PVT1通过“海绵吸附”miR-124，负向调节miR-124的表达。

*：与IgG相比，P<0.05

2.6 Western blot法检测SRA01/04细胞Jagged-1/Notch通路相关蛋白表达

与空白组相比，TGFβ2组Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3蛋白表达显著上调，而GSI-Ⅸ+TGFβ2组、SB431542+TGFβ2组Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3蛋白表达则低于TGFβ2组(P<0.05)，见图6a。此外，同样在TGFβ2作用下，si-PVT1组Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3蛋白表达则低于TGFβ2组和si-control组，同时si-PVT1+miR-124-inhibitor组可逆转si-PVT1对上述蛋白表达的下调作用(P<0.05)，见图6b。

a： TGFβ2对Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3蛋白表达的影响；b：LncRNA PVT1对Jagged-1、Notch-1、Notch-2、Notch-3蛋白表达的影响 *：与空白组相比，P<0.05；#：与TGFβ2组相比，P<0.05；△：与si-control组相比，P<0.05；▲：与si-PVT1组相比，P<0.05；□：与si-PVT1+miR-NC组相比，P<0.05

3 讨论

本研究首先基于微阵列数据，发现LncRNA PVT1在ACS前囊膜组织或TGFβ2诱导的LECs中明显表达上调。进一步的细胞实验证实，TGFβ2可诱导LECs中上皮分化标志物E-cadherin蛋白表达下调，同时间充质细胞标志物FN蛋白表达上调，说明TGFβ2可促进LECs向间充质细胞表型转化。在机制分析实验中，TGFβ2可诱导SRA01/04细胞LncRNA PVT1过表达，这是一个呈剂量依赖性和时间依赖性的过程；而PVT1可负性调节miR-124，进而导致Jagged-1/Notch信号通路激活。因此，我们认为PVT1/miR-124/Jagged-1/Notch轴可能是TGFβ2诱导LECs发生EMT的重要分子机制之一。

LncRNA是非编码转录体，虽然缺乏蛋白质编码能力，但其在调节基因表达方面起着关键作用[8]。LECs发生EMT是导致ASC或PCO等继发性白内障的重要原因，而TGFβ2被认为是一个重要的诱因[2-4]。本研究结果显示，TGFβ2以剂量依赖性和时间依赖性的方式诱导SRA01/04细胞LncRNA PVT1表达上调，这一点在ASC眼的前囊膜组织中也得到证实，说明LncRNA PVT1参与了ASC的病变过程。Western blot结果显示，TGFβ2可抑制上皮分化标志物E-cadherin蛋白表达，同时诱导间充质细胞标志物FN蛋白表达上调，且TGFβ2诱导LECs发生EMT的作用受到LncRNA PVT1基因敲除的影响，下调PVT1基因表达后，miR-124表达相应上调，而TGFβ2对LECs中EMT标志物表达的影响得以改善。因此，我们认为TGFβ2通过PVT1依赖性机制诱导LECs发生EMT。

在分子机制方面，LncRNAs通过与miRNAs相互作用，调节miRNA下游靶基因的表达，发挥其在疾病发生发展中的作用。研究显示，PVT1能与miR-214[9]、miR-26b[10]等相互作用，进而调节细胞下游TGFβ1信号转导，影响肿瘤细胞的侵袭和迁移。本研究双荧光素酶报告基因实验和免疫共沉淀实验证实，PVT1可通过吸附miR-124进而影响miR-124下游通路Jagged1/Notch轴的激活。miR-124属于肿瘤抑制分子，研究显示其在癌症[11-12]、肾间质纤维化[13]等疾病中可以抑制细胞EMT进程。此外，miR-124可以通过调节STAT3抑制视网膜母细胞瘤细胞的活性和侵袭[14]。本研究发现，ASC眼前囊膜组织中miR-124表达下降，说明其参与了继发性白内障的发病，并且miR-124在TGFβ2诱导的LECs-EMT中起着重要作用。目前已发现多种miR-124靶基因与纤维化有关，包括ColⅠ[15]、结缔组织生长因子[16]、Smad4[17]等。在本研究中，我们确定了其另一个靶基因Jagged-1，miR-124可直接与Jagged-1的3’-UTR相互作用，从而负向调节Jagged-1的表达。此外，miR-124也可影响Notch-1、Notch-2和Notch-3受体表达，这意味着miR-124除了直接抑制Jagged-1信号传递外，还可抑制下游Notch受体的表达，进而影响LECs纤维化进程。Notch信号在胚胎发育[18]、肿瘤转移[19]和各种纤维化疾病[20]中起关键作用。因此阻断Jagged-1信号传导，可以整体逆转TGFβ2诱导的LECs-EMT进程。

综上，TGFβ2通过一种LncRNA PVT1依赖机制诱导LECs发生EMT。其机制之一是LncRNA PVT1通过“海绵吸附”miR-124负性调节其表达，进而诱导下游Jagged-1/Notch信号通路激活。因此，PVT1/miR-124/Jagged-1/Notch轴参与了TGFβ2诱导的LECs-EMT进程，而LncRNA PVT1有望成为治疗ASC或PCO的潜在靶点。