THBS1基因编辑BMSCs对变应性鼻炎模型小鼠鼻黏膜屏障功能及炎症反应的影响

王 丽，黄永阳，张 义，綦 彬，万 龙，杜炎平，陈才盛

(黄冈市中心医院耳鼻喉头颈外科，湖北 黄冈 438000)

血小板反应蛋白家族是一类具有多个结构域的钙相关糖蛋白，主要位于细胞膜表面，由于其特殊的三聚体结构，血小板反应蛋白可通过与各种靶蛋白的相互作用，广泛参与多种生理及病理活动过程，如血管生成、细胞运动、细胞黏附、细胞骨架组成和细胞外基质反应[1-2]。血小板反应蛋白1(thrombospondin-1,THBS1)作为血小板反应蛋白家族最早确定的成员，由16 393个碱基组成，包括22个外显子，由包括血小板、巨噬细胞和脂肪细胞等在内的多种细胞分泌，暂存于细胞外基质中，可抑制内皮细胞的迁移及血管内皮生长因子的释放[3]。有研究表明，THBS1在炎症疾病、组织纤维化、组织损伤、多项肿瘤及血管形成过程中均发挥重要作用[4-5]。

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是具有自我更新和多向分化潜力的细胞，具有组织修复功能，并且可作为免疫反应的调节剂。鉴于其免疫抑制特性、组织修复能力和各种生物因子的分泌能力，目前基于BMSCs的疗法已在多种疾病的临床前研究和临床试验中开展，包括心血管疾病、神经系统疾病、器官损伤、器官移植、慢性炎症和自身免疫性疾病等[6-7]。变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)作为一种常见的慢性可逆性鼻腔炎症性疾病，主要表现为阵发性反复打喷嚏、流鼻涕或鼻塞，症状通常连续出现2 d或更长时间，通常会导致嗅觉功能严重受损[8]。AR参与全身炎症过程，并与哮喘、鼻窦炎和过敏性结膜炎等炎症性疾病有关，对患者的睡眠、学习、工作和社交生活均会造成严重影响，并导致更高的社会医疗成本。AR治疗的关键在于防止体内进一步的炎症病变并促进组织功能的恢复。BMSCs移植被认为是一种有潜力的AR治疗方法。本研究通过以THBS1基因编辑的BMSCs移植治疗AR小鼠，观察该作用下小鼠鼻黏膜屏障功能及炎症反应变化，以期为AR的治疗寻找新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

65只SPF级健康BALB/c小鼠，10周龄，雌雄各半，体质量18～25 g，由湖北省实验动物研究中心提供，生产许可证号：SCXK(鄂)2015-0018，饲养于无特定病原体屏障饲养室内，温度22～24 ℃，相对湿度(50±5)%，12 h/12 h明暗周期交替，期间喂食鼠粮，自由饮水。本研究获得我院医学伦理委员会审核批准(KY20210519108)。

1.2 主要材料与试剂

卵清蛋白(ovalbumin，OVA)和氢氧化铝(美国Sigma公司)，胎牛血清、青霉素/链霉素混合液、L-谷胺酰胺、DMEM培养液及胰蛋白酶(美国HyClone公司)，RNAiso Plus、逆转录和实时荧光定量试剂盒(日本Takara公司)，茜素红染液、油红O染液、BCA蛋白测定试剂盒及ECL超敏发光液(上海碧云天生物研究所)，酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，HE染色试剂盒和PAS染色试剂盒(北京索莱宝科技公司)，免疫荧光染色试剂盒(武汉博士德生物公司)，异硫氰酸荧光素标记的CD34、CD45、CD73、CD90及CD105抗体，兔抗THBS1、Claudin-1、CK-5、β-tubulin单克隆抗体和兔抗Occludin、GAPDH多克隆抗体(英国Abcam公司)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG及荧光标记的山羊抗兔IgG抗体(北京康为世纪)。含THBS基因—绿色荧光蛋白EGFP标记的慢病毒载体以及空载体—绿色荧光蛋白EGFP标记的慢病毒载体由上海吉凯基因公司构建、完成包装及滴度测定。

1.3 BMSCs分离与鉴定

将5只BALB/c小鼠以脱臼法处死，无菌环境下取其股骨和胫骨，PBS清洗，断开股骨暴露骨髓腔，用含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素及2 mmol/L L-谷胺酰胺的DMEM培养液反复冲洗，并收集冲洗液置于干净离心管，以4 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤，加入新鲜培养液重悬细胞，以1×106/mL的密度接种于培养瓶，放置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，期间每2 d换液1次。待细胞生长至融合度为80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化，常规传代培养，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况。取第5代呈对数生长的BMSCs，消化后取细胞悬液，分别加入异硫氰酸荧光素标记的CD34、CD45、CD73、CD90及CD105抗体，经流式细胞仪测定细胞表面标记物表达。分别使用成骨完全培养基诱导21 d，以成脂分化培养基诱导14 d，诱导结束后，通过茜素红染色和油红O染色检测细胞成骨与成脂分化能力。

1.4 THBS1基因修饰BMSCs构建

取对数生长的BMSCs，以5×104个/孔的密度接种于24孔板内，置于37 ℃、5% CO2培养箱中过夜培养。次日，在培养孔细胞中添加含THBS1基因—绿色荧光蛋白EGFP标记的慢病毒液或空载体—绿色荧光蛋白EGFP标记的慢病毒液感染BMSCs，分别记为THBS1-BMSCs组、NC-BMSCs组，同时添加感染增强液以提高效果，复感染指数MOI=10，置于细胞培养箱孵育24 h后，更换为含嘌呤霉素的完全培养基进行筛选，以正常培养的BMSCs作为对照组。48 h后用荧光显微镜观察感染后细胞内绿色荧光蛋白EGFP表达。

1.5 实时荧光定量PCR

根据RNAiso Plus试剂说明书提取感染后细胞总RNA，紫外分光光度计测量OD值，确定RNA样品的质量浓度。以总RNA为底物逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板，通过荧光实时定量PCR测定THBS1 mRNA水平，根据定量试剂盒说明书操作，以GAPDH为内参基因，扩增条件：第1阶段，95 ℃ 3 min(1个循环)；第2阶段，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，95 ℃ 15 s(42个循环)。基因引物序列：THBS1上游引物5’-AGCCGCCACATCAAACACATA-3’，下游引物5’-CGCTGGATTCTCAAGTCGTT-3’；GAPDH上游引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’,下游引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。扩增结束后，采用2-△△Ct法计算THBS1 mRNA相对表达水平。

1.6 Western blot

RIPA缓冲液预冷处理后，加入到感染后细胞或研磨后的鼻黏膜组织中，提取总蛋白，以BCA法测定浓度。取等量蛋白样品与5×Loading buffer混合，沸水浴煮沸10 min，上样至10% SDS-PAGE凝胶孔内，80 V恒压电泳20 min后，将电压调为110 V电泳60 min，恒压100 V，冰上2 h转至PVDF膜，加入5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗膜，膜上滴加兔抗THBS1单克隆抗体、兔抗Claudin-1单克隆抗体和兔抗Occludin多克隆抗体，均按1∶1 000稀释，4 ℃孵育过夜；次日，TBST洗膜，加入对应辣根过氧化物酶标记二抗，以1∶5 000稀释，室温孵育1 h。TBST再次洗膜，ECL显色，凝胶成像系统扫膜拍照，Image-ProPlus软件分析条带灰度值，以GAPDH作为内参蛋白。

1.7 动物模型构建与分组处理

60只小鼠随机分为对照组、模型组、BMSCs组、THBS1-BMSCs组，每组15只。除对照组外，其余3组小鼠构建AR模型。AR造模：取适应性饲养后的BALB/c小鼠，参考文献[9]建立AR实验动物模型，首先进行基础致敏，以1 mL生理盐水溶解0.3 mg OVA与30 mg氢氧化铝，混匀制备混悬液，进行小鼠腹腔注射，隔日注射1次，共注射8次，开始注射时记为1 d，16 d后结束，对照组小鼠同时注射等量生理盐水；基础致敏后，进行激发，配制10 mg/100 L OVA，以微量进样器从小鼠双侧鼻腔滴入，每天1次，连续7 d，对照组同时滴入等量生理盐水，22 d后结束。激发后第22～25天，用酒精擦拭鼠尾静脉消毒，对照组和模型组小鼠均尾静脉注射0.1 mL PBS，BMSCs组小鼠尾静脉注射0.1 mL BMSCs(含5×105个细胞)，THBS1-BMSCs组小鼠尾静脉注射0.1 mL经THBS1基因编辑的BMSCs(含5×105个细胞)。

1.8 生物学症状评分

造模后观察各组小鼠活动、摄食及饮水等情况，对其流涕、挠鼻及喷嚏情况进行统计，各项叠加量化计分：喷嚏，1～3个记1分，4～10个记2分，11个以上记3分；流鼻涕，流至前鼻孔记1分，流出超过前鼻孔记2分，流至面部记3分；挠鼻，1～5次记1分，6～15次记2分，16次以上记3分。评分总分大于5分即为造模成功[10]。给药后统计各组小鼠挠鼻与喷嚏次数，并进行比较。

1.9 ELISA测定血清炎症因子水平

通过眼眶采集各组小鼠血液，置于室温下2 h，以4 000 r/min离心15 min，收获血清弃去余物，在-80 ℃冰箱中保存。使用特异性ELISA试剂盒检测各组小鼠血清IFN-γ、IgE、TNF-α、IL-4及IL-6的含量，实验步骤严格按照试剂盒说明书操作。

1.10 HE染色和PAS染色观察鼻黏膜病理形态学

处死小鼠后取鼻中隔黏膜，用4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，连续切片(厚度4 μm)，进行HE染色，中性树胶封固切片，每张切片随机选择5个区域，在光镜下观察组织病理学改变，采集图像储存，计数嗜酸性粒细胞数目，结果以平均值表示。

将制备的鼻黏膜组织切片脱蜡至水，浸入阿利新蓝染液处理15 min，蒸馏水清洗，置于过碘酸溶液中氧化5 min，以SchiffReagent浸染10 min，流水冲洗后，酸性分化液分化，氨水返蓝，经梯度乙醇脱水与二甲苯透明后，中性树胶封固，在光镜下观察统计杯状细胞数目，采集图像储存，同样随机选择5个视野，结果以平均值表示。

1.11 免疫荧光染色检测鼻黏膜CK-5与β-tubulin蛋白表达

将鼻黏膜组织复温并晾干，使用预冷的丙酮固定10 min，PBS清洗，组化笔在组织周围画圈，滴加蛋白酶K液于圈内，37 ℃孵育30 min后，在圈内滴入适量破膜工作液，常温孵育30 min，PBS清洗，3%BSA封闭30 min。弃去封闭液后，在切片上滴加稀释后的兔抗CK-5与β-tubulin单克隆抗体(1∶200)，4 ℃隔夜孵育。次日，弃去原液，加入荧光标记的山羊抗兔IgG抗体(1∶200)，室温孵育2 h，DAPI避光染核10 min，中性树胶封固，在荧光显微镜下观察组织染色情况并采集图像储存，随机选择5个视野，计算各蛋白表达的平均荧光强度。

1.12 统计学分析

2 结果

2.1 BMSCs鉴定

通过倒置显微镜观察分离培养的细胞，可见细胞生长状态良好，大小一致，呈网状或放射状，见图1a。经过茜素红染色和油红O染色后，细胞内出现明显橘红色钙沉淀和红色脂滴积累，见图1b、c。流式细胞结果显示，细胞表面抗原CD105、CD90和CD73均呈阳性表达，而CD34和CD45均呈阴性表达，并具备良好的成骨与成脂分化能力，说明成功分离到BMSCs，见图1d。

a：倒置显微镜观察细胞形态；b：茜素红染色检测细胞成骨分化能力；c：油红O染色检测细胞成脂分化能力；d：流式细胞仪测定干细胞标记物表达

2.2 THBS1基因编辑BMSCs的效果测定

倒置荧光显微镜观察到NC-BMSCs组和THBS1-BMSCs组细胞中均可见明显的绿色荧光蛋白EGFP表达，感染率在90%以上，而对照组未见明显的绿色荧光蛋白EGFP表达，见图2a。实时荧光定量PCR和Western blot检测结果显示，与对照组和NC-BMSCs组比较，THBS1-BMSCs组细胞中THBS1 mRNA和蛋白相对表达量均显著上调(P<0.05)，见图2b、c。

表2 各组小鼠血清炎症因子水平比较

2.3 各组小鼠生物学症状评分

经统计，造模后小鼠生物学症状评分大于5分，提示造模成功。与对照组比较，模型组小鼠出现连续性喷嚏，频繁挠鼻，次数显著增加(P<0.05)；与模型组比较，BMSCs组和THBS1-BMSCs组小鼠喷嚏和挠鼻次数显著减少(P<0.05)；与BMSCs组比较，THBS1-BMSCs组小鼠的喷嚏和挠鼻次数均显著减少(P<0.05)，见表1。

表1 各组小鼠喷嚏与挠鼻次数比较次)

2.4 各组小鼠血清炎症因子水平比较

ELISA结果显示，模型组小鼠血清IFN-γ含量显著低于对照组，IgE、TNF-α、IL-4及IL-6含量均显著高于对照组(P<0.05)；与模型组比较，BMSCs组和THBS1-BMSCs组小鼠血清IFN-γ含量显著升高，IgE、TNF-α、IL-4、IL-6含量均显著降低(P<0.05)；与BMSCs组比较，THBS1-BMSCs组小鼠血清IFN-γ含量进一步显著升高，而IgE、TNF-α、IL-4、IL-6含量均显著下降(P<0.05)，见表2。

2.5 各组小鼠鼻黏膜病理形态学与炎症反应观察

HE染色结果显示，对照组小鼠鼻黏膜结构清晰完整，未见明显上皮细胞脱落与炎症细胞浸润；模型组小鼠鼻黏膜纤毛排列不规则，上皮细胞脱落且间质水肿，有大量嗜酸性粒细胞浸润，嗜酸性粒细胞数目较对照组显著增加(P<0.05)，黏膜下腺体增生；与模型组比较，BMSCs组小鼠鼻黏膜上皮细胞脱落明显减少，层间间质水肿减轻，嗜酸性粒细胞数目显著减少(P<0.05)，腺体增生减轻，THBS1-BMSCs组小鼠鼻黏膜病变得到明显改善，上皮细胞脱落不多，未见明显嗜酸性粒细胞浸润，嗜酸性粒细胞数目显著减少(P<0.05)，腺体轻微增生。

PAS染色结果中深紫色为杯状细胞，经观察发现，对照组小鼠鼻黏膜上皮层未见明显杯状细胞，而模型组小鼠鼻黏膜上皮层可见大量杯状细胞，数目较对照组显著增加(P<0.05)；与模型组比较，BMSCs组和THBS1-BMSCs组小鼠鼻黏膜上皮层杯状细胞数目显著减少(P<0.05)，THBS1-BMSCs组较BMSCs组进一步显著减少(P<0.05)，见图3。

图2 THBS1基因编辑BMSCs结果

*：与对照组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05；△：与BMSCs组比较，P<0.05

2.6 各组小鼠鼻黏膜CK-5与β-tubulin蛋白表达比较

免疫荧光染色结果显示，模型组小鼠鼻黏膜CK-5与β-tubulin的荧光强度均显著低于对照组(P<0.05)；与模型组比较，BMSCs组和THBS1-BMSCs组小鼠鼻黏膜CK-5与β-tubulin的荧光强度均显著增强(P<0.05)；THBS1-BMSCs组小鼠鼻黏膜CK-5与β-tubulin的荧光强度显著高于BMSCs组(P<0.05)，见图4。

*：与对照组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05；△：与BMSCs组比较，P<0.05

2.7 各组小鼠鼻黏膜Claudin-1与Occludin蛋白表达比较

Western blot结果显示，与对照组比较，模型组小鼠鼻黏膜Claudin-1与Occludin蛋白表达水平均显著下调(P<0.05)；与模型组比较，BMSCs组和THBS1-BMSCs组小鼠鼻黏膜Claudin-1与Occludin蛋白表达水平均显著上调(P<0.05)；与BMSCs组比较，THBS1-BMSCs组小鼠鼻黏膜Claudin-1与Occludin蛋白表达水平均显著上调(P<0.05)，见图5。

a:倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白EGFP表达；b:实时荧光定量PCR检测THBS1 mRNA表达；c：Western blot检测THBS1蛋白表达 *：与对照组比较，P<0.05；#：与NC-BMSCs组比较，P<0.05

3 讨论

流行病学研究表明，10%～40%的成年人与2%～25%的儿童患有AR，且AR的患病率在全球范围内不断增加[11]。在病理学上，AR与过敏原特异性IgE介导的针对环境过敏原的免疫反应有关，且经过对鼻—支气管系统功能研究发现，过敏不是局限于某个特定器官，而是涉及整个呼吸道的疾病，并表现出广泛的症状[8]。鼻炎已被确定为哮喘发展的独立危险因素，寻找鼻炎的有效治疗方法可预防或延缓哮喘发作。特应性个体通过激活树突细胞和T淋巴细胞对过敏原敏感，树突细胞位于鼻黏膜表面，通过捕获过敏原并将过敏原肽呈递给引流淋巴结中的T淋巴细胞，引起2型辅助性T淋巴细胞(T-helper lymphocyte type-2，Th2)过敏反应。因此，Th2相关细胞因子的释放增强了B淋巴细胞产生IgE，并促进了鼻组织中嗜酸性粒细胞的募集。更确切地说，IgE分子被释放到血液中并与组织肥大细胞和循环嗜碱性粒细胞表面的高亲和力受体结合，导致预先形成的介质(如组胺)快速释放，从而引发早期症状，如打喷嚏、鼻痒和流鼻涕。而脂质介质(如白三烯C4和前列腺素D2)的产生，通过刺激内皮细胞上黏附分子的表达促进嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和CD4+T细胞等炎症细胞的流入，引起鼻塞等晚期症状[12-13]。目前，常规药物治疗可以缓解过敏症状，但并不能干扰过敏反应。此外，药物治疗后复发以及副作用产生都会影响AR的疗效，严重影响患者的生活质量，因此，寻找更有效的AR治疗策略意义重大。

近年来，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)已被证实可抑制炎症，是一种有前景的治疗AR的疗法。Desai等[14]证实，与过敏性哮喘中的MSCs相比，AR小鼠模型中的MSCs可促进炎症细胞因子的产生并向APCs呈递过敏原，从而促进淋巴细胞增殖；Fan等[15]研究表明，诱导多能干细胞衍生的MSCs可激活CD4+、CD8+T细胞及Treg细胞，调节Th1/Th2细胞因子水平，提高AR患者的调节性T细胞反应，并可根据不同疾病阶段发挥不同的免疫调节功能；Zhao等[16]证明在AR小鼠模型中静脉注射BMSCs可明显减轻过敏症状并减少嗜酸性粒细胞浸润，降低Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-13等水平，升高Th1型细胞因子IFN-γ水平。本研究结果显示，AR小鼠在尾静脉注射BMSCs后，血清IFN-γ含量升高而IgE、TNF-α、IL-4、IL-6含量均下降，抑制了鼻黏膜组织嗜酸性粒细胞浸润与杯状细胞增加的现象。目前，基因修饰和干细胞相结合的疗法是一项研究热点，经过基因编辑的BMSCs输送到机体后，不仅能够发挥干细胞归巢与修复的作用，还可以提高目的基因的表达，两者协同进而起到扩大间充质干细胞治疗疾病的作用[17]。本研究结果显示，相较于BMSCs单独作用，经THBS1基因编辑BMSCs治疗的AR小鼠，其连续性喷嚏、频繁挠鼻等症状进一步缓解，血清IFN-γ含量升高，IgE、TNF-α、IL-4、IL-6含量均下降，同时，鼻黏膜组织嗜酸性粒细胞浸润减轻，杯状细胞也明显减少，由此说明，THBS1基因编辑BMSCs对AR小鼠的改善作用优于BMSCs单独作用。

鼻黏膜上皮屏障作为机体免疫防御的第一道防线，能够抵御外界多种病原菌、毒物等入侵及破坏，对于保护鼻黏膜内部环境至关重要，与AR的发生、发展及好转均密切相关[18-19]。鼻黏膜上皮细胞作为鼻黏膜屏障的主要组成部分，其基本功能是依赖于多种蛋白之间形成的复合物形成紧密连接的能力，从而在气道腔和上皮下组织之间形成物理屏障。其中，Claudin-1与Occludin作为紧密连接蛋白，在细胞连接中发挥屏障及栅栏作用，是决定细胞旁通透性的关键因素，能够显示细胞形成紧密屏障的能力[20]。CK-5主要分布于上皮细胞，作为上皮细胞分化的标志物，能够与膜蛋白形成复杂的网络，主要功能是维持上皮组织的完整性及连续性，并在细胞形态和信号传导中具有重要作用[21]。β-tubulin是细胞的一种骨架蛋白，参与多种重要的细胞功能，如维持结构、运输途径和细胞分裂等[22-23]。本研究结果显示，AR小鼠鼻黏膜CK-5与β-tubulin荧光强度减弱，Claudin-1与Occludin蛋白表达水平均下调，而经BMSCs或THBS1基因编辑BMSCs治疗的AR小鼠的鼻黏膜CK-5与β-tubulin荧光强度增强，Claudin-1与Occludin蛋白表达水平也上调；此外，相较于BMSCs单独作用，THBS1基因编辑BMSCs治疗的AR小鼠鼻黏膜CK-5与β-tubulin荧光更强，Claudin-1与Occludin蛋白表达水平更高，由此表明，THBS1基因编辑BMSCs能够增强鼻黏膜屏障功能，逆转鼻黏膜的重塑。

综上，THBS1基因编辑BMSCs可减轻AR小鼠流涕、打喷嚏等过敏症状，减少嗜酸性粒细胞浸润、杯状细胞过度增殖以及炎症因子的释放，增强鼻黏膜屏障功能，延缓AR进展。然而，THBS1基因编辑BMSCs对于细胞间连接的其他组成部分以及具体机制，仍有待后续进一步研究。