醒神复元合剂质量标准提升研究*

黄伟欣，钟惠娴，胥爱丽,3，李素梅,3，李养学,3

（1.广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院），广东广州 510095；2.广州中医药大学，广东广州 510405；3.广东省中医药研究开发重点实验室，广东广州 510095）

醒神复元合剂为广东省第二中医院的特色制剂之一，由石菖蒲、白芍、当归、制何首乌、陈皮、法半夏、瓜蒌子、莱菔子、黄芪、珍珠母等10味中药制成，全方共奏补气活血，化痰通腑之功效，此方祛邪不伤正，扶正而不恋邪，用于治疗气虚痰瘀证型中风后遗症患者，不失为一首有效的经验方。原质量标准研究中仅对君药石菖蒲、臣药当归运用薄层色谱法（TLC）进行定性鉴别，却没有对主要药效成分进行含量测定。该制剂的君药为白芍，具有养血敛阴，平抑肝阳的功效，临床上用于中风后气血两虚、痰蒙清窍证昏迷等症[1]。其中芍药苷是药材白芍的主要药效成分，具有镇静抗炎镇痛、抗抑郁、调节免疫、心脏保护等多种药理作用[2～3]。因此，为进一步加强对醒神复元合剂的质量控制，提升醒神复元合剂的质量标准，保证该制剂临床用药的安全、有效性，本课题对方中君药石菖蒲、臣药当归的薄层鉴别方法进行了优化，并增加了君药白芍及臣药陈皮的薄层鉴别。该制剂的君药为白芍，其中芍药苷是药材白芍的主要药效成分，具有镇静抗炎镇痛、抗抑郁、调节免疫、心脏保护等多种药理作用[2-3]，将芍药苷作为醒神复元合剂的指标成分并建立高效液相色谱峰（HPLC）对其含量进行测定，完善醒神复元合剂的质量控制标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器 澳华HH-2恒温水浴锅（常州金坛良友仪器有限公司）；RE-52AA型旋转蒸发仪（上海科兴仪器有限公司）；卡玛ATS4自动点样器（瑞士CAMAG公司）；卡玛TLC成像系统（瑞士CAMAG公司）；双杰JJ500电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；TLE-204梅特勒托利多分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）；安捷伦高效液相色谱仪（型号：1260/1200，美国安捷伦公司）。

1.2 试剂 石菖蒲对照药材（批号：121098-201807）、当归对照药材（批号：120927-201617）、白芍对照药材（批号：121905-201610）、陈皮对照药材（批号：120969-201510）、芍药苷（批号：110736-201943，质量分数95.1%），均购买自中国食品药品检定研究院。乙腈、乙醇为Merck色谱纯试剂，液相用水为屈臣氏饮用水，三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等其他试剂为分析纯。

1.3 分析样品 醒神复元合剂（250mL/瓶，批号分别为（20190103、20190601、20200503），均由广东省第二中医院制剂室生产提供。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

2.1.1 石菖蒲鉴别 取醒神复元合剂10mL，用稀盐酸调pH值至2～3，高速离心（3000r/min）5min，取上清液，加乙醚20mL振摇提取2次，合并上层乙醚提取液，水浴蒸干提取液，残渣中加入1mL甲醇使溶解作为石菖蒲供试品溶液。另取石菖蒲对照药材1g，加实验用水50mL，煮沸，微沸30min，趁热用纱布过滤，滤液放冷至室温，用稀盐酸调pH值至2～3，同法制成石菖蒲药材溶液。分别吸取上石菖蒲述供试品溶液5μL，石菖蒲对照药材溶液10μL，用Cyciohexane-乙酸乙酯（8:3）为展开剂，展开，取出，热风吹干，放置约1小时至日光下斑点显色清晰。在365nm下，石菖蒲供试品色谱中，在与石菖蒲对照药材色谱相应的位置上，出现相同的荧光斑点，说明此方法可行。

2.1.2 当归鉴别 取石菖蒲项下处理的石菖蒲供试品溶液作为当归的供试品溶液。另取当归对照药材1g，移取50mL 1%碳酸氢钠溶液，超声处理10min，高速离心（3000r/min）5min，取上清液，用稀盐酸调pH值至2～3，同法制成当归药材溶液。将上述当归对照品溶液、当归对照药材溶液各吸取10μL，以Cyciohexane-乙酸乙酯（8:3）为展开剂，展开，取出，室温下自然晾干。在365nm下，当归供试品在与当归对照药材相应位置的色谱图中，显相同的荧光斑点，说明此方法可行。

2.1.3 白芍鉴别 取醒神复元合剂10mL，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径1.5cm，柱高为10cm），用水洗至无色，然后用20%乙醇100mL洗脱，流速1滴/秒，收集20%乙醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加1mL甲醇作为白芍供试品溶液。另取白芍对照药材1g，加甲醇20mL，振摇5min，棉花滤过，滤液水浴蒸干，残渣加1mL甲醇作为白芍药材溶液。吸取白芍供试品溶液、白芍对照药材溶液各10μL，以Chioroform-乙酸乙酯-Methanol-甲酸（40:5:10:0.2）为展开剂，展开，取出，热风吹干，然后均匀喷以5%香草醛硫酸溶液在薄层板上，105℃烘至斑点显色清晰。在日光下，白芍供试品在与白芍对照药材相应位置的色谱图中，显相同的荧光斑点，说明此方法可行。

2.1.4 陈皮鉴别 取醒神复元合剂10mL，水浴蒸至近干加适量硅藻土混匀，蒸干加入20mL乙酸乙酯，超声10min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣中加入1mL甲醇作为陈皮供试品溶液。另取陈皮对照药材1g，加水50mL，煮沸，微沸30min，趁热用纱布过滤，水浴蒸至近干加适量硅藻土混匀，蒸干加入20mL乙酸乙酯，同法制成陈皮药材溶液。吸取上述陈皮供试品溶液、陈皮对照药材溶液各10μL，以Toluene-乙酸乙酯（3:2）为展开剂，发现陈皮供试品色谱与陈皮对照药材色谱对应良好，斑点清晰，分离度好，说明此方法可行。见图1。

2.2含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：PhenomenexKinetex XB C18（5μm，4.6×250mm）；流动相：Acetonitrile-0.1%磷酸溶液（15：85）；柱温：25℃；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；检测波长：230nm；理论塔板数不低于2000，进样量10μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称定芍药苷对照品3.15mg于50mL容量瓶中，通过公式计算需要稀释的倍数，加甲醇定容，制成每1mL含59.91μg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 拿单标移液管取本品约5mL，置50mL量瓶中，加50%乙醇溶液稀释至刻度，混匀，超声处理（功率240W，频率45kHz）5min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性样品溶液的制备 按照醒神复元合剂的配方，除去白芍后剩下的九味药材进行煎煮，然后制成阴性对照样品溶液。

2.2.5 专属性试验 将上述溶液各取10μL，按“2.2.1”项下的条件进样，结果表明，阴性对照溶液色谱图中芍药苷峰处无干扰，说明其他药材对芍药苷的测定无干扰，见图2。

图2 醒神复元合剂高效液相图谱

2.2.6 线性关系考察 用刻度移液管分别精密吸取不同体积芍药苷对照品溶液适量，置10mL量瓶中，用甲醇定容，摇匀，上下倒置摇匀，制得标准曲线的六个不同浓度的芍药苷溶液，分别精密吸取10μL，注入液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，分别进样10μL，以芍药苷对照品μg/mL为横坐标（X），测定的峰面积为纵坐标（Y），绘制芍药苷标准曲线，计算回归方程，得线性回归方程为Y=13733.1733X+6982.7718，r=0.9999(n=6)。结 果 见表1。

表1 芍药苷标准曲线

2.2.7 精密度试验 取芍药苷对照品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算得到芍药苷峰面积的RSD为1.92%，表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取同一批醒神复元合剂供试品（S2），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、10、12h进样测定，计算得到峰面积的RSD为1.20%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.2.9 重复性试验 取同一批醒神复元合剂供试品（S2），按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件依次进样测定，计算得到芍药苷含量的RSD为1.43%，表明该方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 取同一批醒神复元合剂供试品（S2）约2.5mL，精密称定6份，分别置50mL量瓶中，加入各对照品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件依次测定，计算得到平均加样回收率分别为96.75%，RSD分别为1.22%，见表2。

表2 醒神复元合剂芍药苷平均加样回收率测定结果（n=2）

2.2.11 样品测定结果 取3批醒神复元合剂样品，按“2.2.2”项下方法制备样品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，计算样品中芍药苷的含量，结果见表3。

表3 不同批次醒神复元合剂芍药苷含量测定结果

3 讨论

3.1 定性鉴别药材选择 原标准石菖蒲TLC项下，供试品的处理加石油醚（60～90℃）振摇提取，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（4:1）为展开剂，碘蒸气熏后，置紫外光灯（365nm）下检视，供试品色谱与对照药材色谱有斑点对应，但斑点较模糊。参考相关文献，本研究根据石菖蒲所含化学成分的理化性质，供试品用稀盐酸调pH值至2～3，加乙醚振摇提取，以环己烷-乙酸乙酯（8:3）为展开剂，展开，取出，晾干，放置约1小时至斑点显色清晰，置紫外光灯（365nm）下检视。结果显示，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且制备的石菖蒲供试品溶液可继续为白芍TLC鉴别所用。原标准当归TLC项下，供试品用稀盐酸调pH值至2～3，用乙醚振摇提取，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4:1:1:0.1）为展开剂，置紫外光灯（365nm）下检视。结果表明，供试品色谱在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰，但供试品色谱的斑点有拖尾现象；将展开剂更换为环己烷-乙酸乙酯（8:3），结果供试品色谱在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，各斑点分布均匀，主斑点更清晰。采用薄层色谱法对醒神复元合剂中的君药石菖蒲、白芍、臣药当归与陈皮进行定性鉴别，斑点分离清晰，阴性对照无干扰，专属性强，重复性好，可作为醒神复元合剂有效的定性鉴别研究。曾考察不同药材的TLC，其中制何首乌、法半夏、黄芪阴性有干扰，故未列入质量标准；瓜蒌子、莱菔子、珍珠母未检出相应斑点，未纳入质量标准。

3.2 含量测定成分选择 醒神复元合剂中君药白芍具有养血调经、柔肝止痛、敛阴止汗的功效，是临床上最常用的中药之一，主要成分包括挥发油类、单帖类、三萜类、黄酮类化合物等[2-4]。其中，含量较高的成分芍药苷是白芍发挥功效的主要活性成分，具有抗抑郁、抗炎、镇痛、保肝等药理作用。芍药苷具有明显的抗抑郁作用，其机制可能与其下调大脑皮质及海马组织中NO/cGMP通路有关。除此之外，芍药苷还可通过免疫调节作用治疗常见的多发性硬化症[8-11]。综合考虑，选择芍药苷作为醒神复元合剂含量测定控制指标。按本标准拟定的方法对3批醒神复元合剂样品进行测定，结果显示芍药苷含量均约等于0.78mg/mL，说明同一厂家生产的样品，芍药苷的含量接近，生产工艺稳定。经过对3批样品的含量测定结果分析，增加芍药苷的含量测定项目对提升醒神复元合剂的质量标准有必要，通过标准提升反馈与厂家，促使厂家自觉主动改进生产工艺，严控原药材的质量，有利于控制产品质量，保证产品的有效性。

3.3 方法评价 本试验中建立了醒神复元合剂中君药石菖蒲、白芍，臣药白芍、陈皮的定性鉴别及主要有效成分芍药苷的含量测定方法，经方法学验证，所建立的方法精密度高，重复性好，稳定可靠，可用于醒神复元合剂的质量控制。