作物氮高效利用的分子生物学研究及在甘薯上的研究展望

范文静， 刘 明, 李铁鑫， 吴德祥， 赵 鹏，靳 容, 张强强， 张爱君, 唐忠厚*

(1.安徽农业大学 农学院，安徽 合肥 230036； 2.江苏徐州甘薯研究中心，江苏 徐州 221131)

氮素是作物生长发育中不可缺少的营养元素之一，它不仅是构成作物体内许多重要化合物的组成元素，而且参与许多植物生长中的生理生化过程.2015年,我国推出化肥施用零增长计划.据农业农村部统计，2020年我国化肥利用率达到40.2%，实现了减量增效[1].过量施用氮肥不仅影响作物产量和品质，还会造成土壤结构破坏、水体富营养化和温室气体排放加剧等环境隐患，也导致氮利用相关基因的遗传多样性丢失.甘薯具有超高产、广适、抗旱、耐瘠薄、易恢复生长等特点和抗癌保健功能，已成为乡村振兴、产业扶贫的先锋作物和国内粮食稳产保供、抗灾夺丰收的潜力作物，其产量的稳定增长对保障粮食安全有重要作用[2].甘薯生育期内，氮素的吸收、同化效率对产量形成和薯块品质有很大影响.氮素过量会造成地上部徒长，降低薯块形成期的氮利用效率(NUE)，抑制不定根形成层活动，加剧中柱细胞木质化程度，影响养分的运输，不利于结薯[3].另外，我国较低的氮肥利用率出现了作物高肥低效的现象，增施氮肥的生产成本也加重了农民的经济负担，使得行业现状不乐观[4].NUE受基因型和环境影响较大，其调控网络在氮素吸收、转运、同化和再分配过程中有多种遗传因子参与[5].因此，培育氮高效品种、利用基因组学分析氮高效基因的调控网络，以此提高作物氮素利用效率是很有必要的[6].甘薯基因型差异与NUE息息相关[7]，农业生产上通过选育氮高效型品种提高作物NUE[8-9].这对定向改良甘薯品种具有重要意义，也可在一定程度上缓解农业生产和自然环境之间的矛盾.本文综述了分子生物学领域作物氮素高效利用的研究进展，包括氮高效遗传位点定位和候选基因功能分析，并展望甘薯氮高效利用的研究方向.

1 氮高效候选基因的定位

1.1 QTL(quantitative trait locus)定位氮高效基因

随着基因组学和功能基因组技术的成熟，氮高效型品种选育不再拘泥于传统育种.近年来，国内外学者利用多组学和分子生物学手段对植物中有关氮高效基因进行挖掘和研究，解析其分子调控机制，为现代分子育种和遗传改良提供了理论支持.

利用表型数据和一系列生物信息学分析挖掘某一作物的目的性状连锁基因的技术已经相当成熟[10].QTL定位被应用于一些作物养分利用的遗传研究，通过表型值和分子标记间的连锁不平衡来确定各个QTL在染色体上的位置、效应以及互作效应[11].QTL是染色体上控制数量性状的基因座，受环境影响较大，因此,遗传群体选择越大越好.李培德[12]利用水稻RILs(重组自交系)作为供试材料，在不同氮素水平下共检测到13个与氮利用效率性状相关的QTLs.白建江[13]利用NUE高的籼稻品种和NUE低的粳稻品种TR22183作为杂交亲本，构建F9代稳定遗传的RILs，并对氮素籽粒生产效率等相关性状进行QTL定位分析，结果表明，有1个稻草氮素含量的主效QTL(qNCOS-4)在抽穗后15、25 d和成熟期均有表达效应；抽穗15 d后，检测到与氮效率性状有关的主效QTLs有15个.王雨等[14]利用来源于9311(籼稻)与日本晴(粳稻)杂交后代衍生的遗传背景为9311的染色体片段代换系群体，插入日本晴片段的CSSL(染色体片段代换系)群体，检测到38个QTLs与2个氮素水平中的有效穗数、籽粒产量相关联.杨习武等[15]以水稻CSSLs为材料，对高低氮条件下的6个性状进行QTL鉴定，检测到高氮条件下13个QTLs，低氮下10个QTLs，高低氮下12个，其中2个QTL热点区中，第1条染色体短臂末端的QTL区段未被报道过.不同氮高效QTL位点调控不同的农艺性状，如在低氮胁迫下鉴定到控制水稻根长和根鲜质量的2个QTL位点qRL1-1和qRFW2-1[16].高易宏等利用正向遗传学手段发现了水稻中控制纤维素水平和氮利用效率的QTL共定位-转录因子MYB61，可被氮胁迫诱导表达，受氮代谢关键控制因子GRF4正向调控；而导致粳稻日本晴与籼稻9311纤维素合成和氮素利用效率差异的主要原因是前者插入转座子helitron，下调MYB61表达[17].氮效率性状的QTL定位研究大多在水稻[16]、小麦[18]、玉米[19]中，而甘薯中未见报道.

1.2 全基因组关联分析(GWAS)定位氮高效基因

较之传统QTL定位，近年来GWAS在解析植物数量性状遗传机制方面的应用越来越广，如用于鉴定和定位基因[20]，即在全基因组范围内找出单核苷酸多态性(SNP)变异位点，在LD(连锁不平衡)较高水平下分辨率较高[21].GWAS中常用的分子标记是SNP和插入/缺失多态性(InDel)等，前者是由单个核苷酸转换、颠换、缺失和插入引起的变异，具有稳定遗传、位点丰富和特异性高等特点[22-23]；后者是指同源序列中核酸片段插入或缺失的现象，在基因组中广泛分布，密度大，数目多[24].简单重复序列(SSR)也是分子标记的一种，刘智怡[25]利用GLM和MLM模型关联到47个SSR标记与氮素利用效率极显著相关，并且通过对显著关联位点RM574进行SNP标记加密以及利用氮素响应转录组图谱，筛选出在氮素高效利用中发挥作用的LOC-Os03g19420基因；2019年，Tang等[26]在水稻群体中利用GWAS分析极端氮相关表型性状，鉴定到了硝酸转运体OsNPF6.1HapB单倍型，其通过增强氮素吸收来提高NUE，该单倍型由转录因子OsNAC42差异反式激活；2021年,Yu 等[27]鉴定到与氮素同化相关的NIN-like转录因子OsNLP4，该基因通过结合其靶标基因OsNiR启动子上NREmotif(氮素回收转录因子结合域)提高OsNiR转录水平和氮素同化水平.因此，利用GWAS关联到显著位点，筛选候选基因并利用RNAi等方法[10]对其进行功能验证，解析该位点在调控NUE通路中的应答模式，构建上下游基因调控网络,是作物改良遗传育种的重要方法[6].

2 氮高效候选基因的表达分析

2.1 氮素转运蛋白家族基因功能研究

植物吸收转运铵态氮主要通过铵转运蛋白(AMTs)，其中OsAMT1.1、OsAMT1.2、OsAMT1.3属于OsAMT1亚族，低氮环境中3者协同调控水稻生长和氮素吸收，在缺氮和不同铵盐浓度处理下，水稻根中的积累水平不同；低铵盐浓度下，3个转运蛋白的单突变体均不影响水稻生长和氮素积累，amt1.1：1.2双突变体的生物量和氮含量降低30%，amt1.2：1.3双突变体生长情况未受影响，而三突变体地上部生长受到抑制，氮素积累下降72%；高浓度铵盐或者硝酸盐处理时各种突变体的生物量和氮积累量几乎不受影响，且三突变体在不施氮肥的田间处理中产量、生物量和氮素积累量均下降[36].

有关氮高效基因的研究在水稻中报道较多，目前已克隆并验证了多个水稻氮高效基因，如：NRT1.1B、NR2和OsNPF4.5参与水稻硝酸盐吸收、转运正向调控[29，37-38]；携带DEP1-1的水稻表现氮响应不敏感性营养生长，以增加氮吸收和同化作用[39]；NR2[37]、NAC42-NPF6.1[26]和NGR5[40]则分别参与调控水稻分蘖(穗数)响应氮利用效率；GRF4[41]调控水稻氮代谢及同化基因的表达；Nhd1[42]控制氮同化的负调控通路，受谷氨酰胺含量正反馈调节，其表达量下调OsFd-GOGAT的表达和活性，敲除Nhd1则会使低氮水平的NUE提高；ARE1[43]、OsNLP4[44]、OsNAR2.1和OsNRT2.1a共同过表达[45-46]；AtAMT1.3[47]可以调控水稻根系吸收不同形态氮素，影响产量和氮素利用效率.有关硝酸转运蛋白基因在玉米[48]、大麦[49]、谷子[50]和茶树[51]的克隆及功能研究均有报道.

2.2 其他氮高效基因功能分析

3 氮高效利用分子生物学技术在甘薯上的研究展望

目前,利用现代科学技术如何实现作物的减肥增效是农业生产上的难题.甘薯是块根类作物，其光合产物直接由源器官运输到块根，氮肥过量会使藤蔓旺长，源库关系失衡，造成减产，影响经济效益；氮素缺乏也会造成光合产物供应不足而减产.因此，提高甘薯氮素利用效率，保障甘薯经济学产量的首要手段是培育氮高效品种，发挥作物本身潜力.

尽管氮高效基因在水稻、小麦和玉米中的研究报道已经很多，但在甘薯中却未有报道，有关提高NUE的方法多集中在栽培生理方向，例如：氮肥施用量[58]、分期运筹[59]等对甘薯源库关系产量、品质和NUE的影响；在甘薯生长前期，调控硝态氮和铵态氮配施比例可以显著提高氮积累量、酶活性和调控基因表达量[60]；大田作业中，减氮会显著降低整个生育期内甘薯光合效率，不利于产量的形成[61].相比传统的QTL连锁分析，GWAS技术的成熟为分子育种带来了巨大便利，结果也更加准确和高效，可将其应用于甘薯氮高效基因研究中，填补甘薯氮养分利用分子研究上的空白.目前，甘薯的基因组测序已基本完成，可结合全基因组分析和多种组学分析，对甘薯群体进行遗传多样性调查，挖掘遗传群体中氮效率性状的优异等位变异并进行功能验证，解析该候选基因在甘薯氮信号传导通路中的作用机制；利用基因工程技术调控靶位点来提高NUE[62]，为甘薯抗性育种和低氮高产栽培提供支持.