纳米酶催化机理及其在农产品检测中的应用研究

翟荣启 张凯歌 刘广洋 黄晓冬 陈 鸽 徐东辉

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业农村部蔬菜质量安全控制重点实验室，农业农村部蔬菜产品质量安全风险评估实验室（北京），北京 100081）

农产品质量安全问题关系到人民的生命健康，为了减少农产品质量安全事件的发生，开发准确的检测方法对于监测农产品质量安全具有重要意义[1]。目前市场上的农药残留检测方法主要分为两大类，一类是以气相色谱、液相色谱、气相色谱质谱联用和液相色谱质谱联用为主的确证检测技术，另一类是以酶抑制法、酶联免疫法、适配体检测法为主的快速检测技术[2]。确证检测技术具有稳定性高和重现性好等优点，但也具有成本高、耗时长、操作复杂等缺陷，不能满足我国鲜活农产品质量安全的检测需求。因此，操作简便、成本低、耗时短的酶抑制法和酶联免疫法等快速检测技术受到众多研究学者的青睐[3]。

酶抑制法和酶联免疫法中最常应用的酶为天然生物酶[3～4]。天然生物酶是一类重要的生物催化剂，绝大多数的天然生物酶由蛋白质组成，因其在高温、过高或过低pH等环境中极易降低或者丧失催化活性，对环境的耐受性较差，致使应用该类生物酶的检测分析技术的准确性受到影响[5]。为了弥补天然生物酶耐受性差等缺陷，研究人员开发出具有环境耐受性高、适用性广、制备过程简单和成本低廉等优点的纳米酶。近年来，纳米酶在农业污染物检测 （如农药、重金属、真菌毒素检测）[6]、医疗诊断[7]、抗菌治疗[8]等领域的应用越来越广泛。本文从酶催化反应的角度对纳米酶进行分类，并阐述了不同种类纳米酶的催化机理，为纳米酶在农产品检测领域中应用提供理论基础。

一、纳米酶及其催化机理

纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的模拟酶。自2007年YAN等首次发现磁性四氧化三铁（Fe3O4）纳米粒子具有过氧化物酶活性以来，越来越多的纳米材料被证明具有催化活性[9]。在农产品快速检测领域，纳米酶按活性主要分为氧化酶和过氧化物酶两类。纳米酶的催化活性随尺寸大小、形貌结构、表面修饰和活性位点的变化而变化。通过调节纳米酶尺寸大小和活性位点、改变纳米酶形貌结构和表面修饰，可实现纳米酶催化活性的精准调控[10]。因此，探明纳米酶催化反应机理对精准调控纳米酶的催化活性具有重要意义。

过去的20年中，越来越多的纳米材料被证明具有催化活性，然而对许多纳米酶的催化机理缺乏深入研究[11]。笔者从纳米酶活性分类的角度对纳米酶的催化机理进行系统概括。

（一）氧化酶氧化酶作为重要的酶类之一，其反应机理是在分子氧（O2）的存在下催化底物的氧化。氧化酶可以根据催化底物的类型对其进一步分类，如葡萄糖氧化酶、亚硫酸氧化酶等[12]。目前，研究人员已经发现钼基、金基、铈基等纳米酶具有氧化酶活性[13～15]。

金纳米粒子（AuNPs）是具有葡萄糖氧化酶活性的纳米酶，其反应机理最早由ROSSI等提出。具体反应原理是在碱性条件下，葡萄糖分子与OH－作用生成水合葡萄糖阴离子，水合葡萄糖阴离子与AuNPs表面相互作用，生成表面富电子的AuNPs，其亲核攻击分子氧，实现了从葡萄糖阴离子到O2的电子转移，从而生成葡萄糖酸和H2O2。在此过程中，AuNPs作为水合葡萄糖阴离子与O2之间电子转移的桥梁[16]。为了进一步证明纳米酶具有氧化酶催化活性，HAYAT等[17]探究了氧化铈对多巴胺的氧化反应，证明了氧化铈纳米酶具有氧化酶活性。此外，CHEN等[18]首次发现氧化亚铜纳米粒子（Cu2ONPs）可以实现对生物大分子底物细胞色素c（Cytc）的催化，反应过程中Cu2ONPs主要作为电子转移的载体，实现对底物的氧化（见图1）。

图1 氧化亚铜纳米酶模拟细胞色素c氧化酶示意

以上具有氧化酶活性的纳米酶，其主要催化机理是纳米酶作为电子转移的桥梁，实现了电子从氧化剂到还原剂的转移，从而实现了对氧化还原反应的催化作用。

（二）过氧化物酶过氧化物酶可以分解各种过氧化物（ROOH、H2O2）来氧化底物。常见的过氧化物酶有辣根过氧化物酶（HRP）、细胞色素c过氧化物酶等[19]。

普鲁士蓝化学式为Fe4［Fe（CN）6］3，其是一种铁基纳米材料。ZHANG等[20]研究发现Fe4［Fe（CN）6］3纳米粒子并非是由芬顿反应产生羟基自由基，而是抑制羟基自由基的产生。在酸性条件下，H2O2将Fe4［Fe（CN）6］3纳米粒子氧化为柏林绿或普鲁士黄，反应底物的电子通过柏林绿或普鲁士黄转移到H2O2，从而实现对底物的氧化。此外，五氧化二钒（V2O5）纳米酶通常表现出钒卤过氧化物酶模拟活性[21]。

过氧化氢酶属于过氧化物酶的一种，其可以将过氧化氢分解为水和氧气，在化工、食品、环境检测方面有重要的作用。金属基纳米材料、金属氧化物纳米材料和普鲁士蓝等都表现出类过氧化氢酶的性质。过氧化氢酶可以利用过氧化氢将RH2（酚、醛、醇等）氧化，当过氧化氢的浓度过高时，过氧化氢酶可以将过氧化氢进一步分解为水和氧气[22]。

WANG等[23]讨论了Fe3O4磁性纳米粒子（Fe3O4MNPs）作为过氧化氢酶的催化机理，以Fe3O4MNPs催化罗丹明B（RhB）降解为例，Fe3O4MNPs的表面吸附大量的H2O2，然后被其表面的Fe2+和Fe3+激活，生成·OH和·O2－/HO2·自由基催化RhB的降解（见图2）。

图2 Fe3O4纳米酶模拟过氧化氢酶的反应原理示意

此外，ZHAO等[24]发现羰基纳米酶具有类过氧化氢酶活性，其催化机理也是通过自由基机理进行的。该团队设计了多种结构的羰基纳米酶，发现大型芳香族结构域对羰基纳米酶的过氧化氢酶活性具有重要作用。由于羰基纳米酶模拟过氧化氢酶的催化活性来源于其催化H2O2产生·OH自由基的能力，因此，HUANG等[25]采用荧光标记技术检测羰基纳米酶与H2O2相互作用的产物，证明了羰基纳米酶模拟过氧化氢酶的催化机理中酮羰基是作为催化的活性位点，羧基是作为底物的结合位点，完成对底物的催化。综上可以看出，具有类过氧化氢特性的纳米酶反应机理主要是由纳米酶表面与H2O2相互作用产生·OH自由基，之后进一步与底物发生反应，从而实现对底物的催化[26～27]。

二、纳米酶在农产品检测中的应用

相较于天然生物酶，由于纳米酶具有易制备、成本低、稳定性好、粒径可控、比表面积大、活性可调控等多种优势，受到许多研究学者的青睐。近年来，纳米酶被广泛地应用于农产品检测领域。笔者将相关研究文献中应用纳米酶检测农药、真菌毒素、金属离子的催化机理、基质、线性范围、检测限等情况进行了整理汇总（见表1）。

表1 纳米酶在农产品检测领域中的应用

（一）氧化酶氧化酶在农产品真菌毒素残留快速检测中起到重要的作用[13～15]。HUANG等[32]利用具有氧化酶活性的复合氧化物MnCo2O4纳米酶构建的比色方法检测玉米中的赭曲霉毒素A（OTA），MnCo2O4纳米酶的Km值比HRP高50倍，表明MnCo2O4纳米酶对底物的亲和力高于HRP，并且MnCo2O4纳米酶无需H2O2参与反应，提高了方法的稳定性，证明了MnCo2O4纳米酶相较于HRP更适合生物传感器的应用。此外，TIAN等[33]利用碱性磷酸酶－二氧化锰（MnO2）类氧化酶串联催化放大体系痕量检测葡萄汁中的OTA（见图3），发现MnO2的催化活性可以存在60 d，证明了MnO2纳米酶的环境耐受性更强。LAI等[35]采用MnO2纳米酶对黄曲霉毒素B1（AFB1）进行快速检测，经试验证明，在多种真菌毒素的干扰下，利用MnO2纳米酶的检测方法仍表现出了良好的特异性，能够准确地检测目标物，检出限远低于我国最大残留限量标准，其线性范围在0.05～150 ng/mL之间。

图3 MnO2纳米酶级联比色传感器检测赭曲霉毒素A的反应过程

（二）过氧化物酶二氧化锗（GeO2）、氧化镍（NiO）、金（Au）、铂（Pt）等许多纳米材料具有过氧化物酶的活性，在检测领域中被广泛应用。过氧化物纳米酶催化四甲基联苯胺（TMB）、邻苯二胺等发光底物显色，产生光学信号以实现对目标物的检测，在农药、真菌毒素、金属离子检测等方面具有广泛应用。

1.农药检测方面。为了实现对有机磷农药的快速检测，GUAN等[28]开发了turn－on模式的有机磷化学发光检测方法，其原理是乙硫磷和乙醇与Fe3O4纳米粒子争夺结合位点，抑制Fe3O4纳米酶活性，降低化学发光强度以实现对乙硫磷的检测（见图4）。上述实验过程中，Fe3O4纳米酶在酸性、有机溶剂等极端条件下仍具有良好的催化活性。此外，将具有过氧化物酶活性的纳米酶的催化特性与比色检测方法结合，可用来检测有机磷农药。GeO2纳米颗粒具有过氧化物酶的催化活性，可催化TMB显色，利用其特性构建的GeO2－乙酰胆碱酯酶（AChE）反应体系能准确地检测农产品中对氧磷[30]。GeO2纳米酶 在pH 4.0～7.0范围内可保持95%以上的相对活性，在50℃内可保持90%以上的相对活性，在90℃下仍保持约50%的原始活性，证明了GeO2纳米酶具有良好的稳定性。有研究表明，钯（Pd）－Au纳米酶也具有过氧化物酶的活性，通过催化H2O2氧化使底物邻苯二胺显色，结合马拉硫磷对Pd－Au纳米酶活性的抑制作用，构建了马拉硫磷比色检测方法[31]。利用Pd－Au纳米酶通过电化学和荧光标记物结合，分别构建的电化学传感器[40]和荧光传感器[36]，被广泛地应用于农产品质量与安全检测中。

图4 类过氧化氢酶活性的Fe3O4纳米酶检测有机磷农药的反应原理示意

具有类过氧化物酶活性的纳米酶也被用于修饰电极，增强传感器的灵敏度，实现对农药的检测。KHAIRY等[6]开发的用氧化镍（NiO）纳米酶修饰的丝网印刷电极对有机磷农药具有较强的吸附作用，可实现对多种样品中对硫磷残留的快速测定，检测限可达24 nmol/L。

2.真菌毒素检测方面。真菌毒素在食品安全案例中被广泛关注，为了降低真菌毒素带来的风险，科研人员开发出类过氧化物活性的纳米酶的比色传感器用于真菌毒素检测。此类传感器对TMB具有良好的催化活性，促使TMB显色，此时加入真菌毒素－适配体可以使纳米酶表面活性位点被屏蔽，抑制其催化作用，减弱TMB显色。若待测样品中存在真菌毒素，便会与适配体结合，从纳米酶上脱落，纳米酶催化活性恢复，TMB再次显色。基于AuNPs－H2O2－TMB催化体系的玉米赤霉烯酮（ZEN）比色检测方法也采用了上述原理[34]。

3.金属离子检测方面。具有类过氧化物酶性质的纳米酶在金属离子的快速检测中发挥了巨大作用。对金属离子的检测也是通过建立比色传感器来实现的，不同金属离子对类过氧化物酶的纳米酶的催化活性不同。在AuNPs表面修饰降低催化活性的K+适配体后[36]，可以使其负电荷密度增强，而催化底物TMB带有正电荷，两者之间亲和力增强，TMB显色增强。当待测物中存在K+时，金属离子会与适配体优先结合，AuNPs和适配体之间不再进行电子转移，类过氧化物酶的纳米酶催化活性下降，实现对K+的快速检测。其测定的线性范围为0.1～1 000 nmol/L，检出限（LOD）可达到0.06 nmol/L，证明了AuNPs纳米酶具有良好的催化活性。ZHANG等[37]采用组氨酸（His）修饰的钯纳米粒子检测Ag+，使其对H2O2－TMB显色的催化作用得到提高。将Ag+加入上述体系，His会与纳米酶分离，Ag+与His之间存在强相互作用，使得钯纳米酶催化活性降低，在30～300 nmol/L的线性范围内实现高灵敏度地测定Ag+，检测限低至4.7 nmol/L。除此以外，研究发现Fe2+具有提高纳米酶类过氧化物酶催化活性的作用[39]，结合类过氧化物酶纳米酶制备的比色传感器简单、灵敏度高且响应快，对金属离子的选择具有特异性。

上文中研究人员基于不同纳米酶模拟酶的反应机理，结合检测物质和基质的性质，从反应机理角度去设计和修饰纳米酶，从而提高了检测灵敏度和结果可靠性。此外，纳米酶因其具备的催化特性，在医学、环境等领域也有着广泛的应用。

三、结论与展望

近20年来，许多纳米材料的催化活性被发掘，其中包括金属基纳米酶、金属氧化物或硫化物纳米酶、羰基纳米酶。纳米酶以优异的催化活性、良好的稳定性、活性可调节等优点，结合比色法、荧光法、化学发光法、传感器法等检测技术，被广泛应用于农产品的农药、真菌毒素、金属离子等物质的快速检测，不仅获得了良好的灵敏度、检出限，而且在一定程度上克服了传统检测方法的缺陷。

虽然纳米酶的应用已经取得较大的发展，但是对纳米酶催化机理的研究仍然面临着巨大挑战。首先，纳米酶的材料来源广泛，不同材料的纳米酶可能具备相同的模拟酶活性，但其催化机理完全不同。其次，纳米酶表面结构具有异质性，不同纳米酶的异质组成和表面结构的差异，导致了纳米酶催化机理的复杂性。对纳米酶的研究目前仍处于初级阶段，其应用于样品目标物的检测仍处于实验室阶段的理论研究，对于其商品化应用到实际样品中检测仍有很多的研究工作需要开展。未来纳米酶的设计和发展或朝着以下几个方向：一是多元设计新型纳米酶；二是精准调控纳米酶的催化活性；三是全面阐明纳米酶催化机理；四是深入开发纳米酶特异性识别功能。总结来说，纳米酶在农产品检测中的应用前景广阔，更多未知纳米酶亟需被发现，纳米酶的研究开发任重而道远。