酒精性肌病相关炎性因子和氧化应激标志物水平的Meta分析

汪楠 ，Oleksandr Motuziuk，Iryna Mishchenko，周颖婷

长期过量饮酒或急性酒精中毒会对各器官、系统产生负面影响，从而增加死亡率［1］。在全球范围内，饮酒是第七大死亡风险因素。在中青年人群中，约12.2%的男性死亡归因于酒精摄入［2］。传统意义上，适度饮酒可以降低冠心病等疾病的发病率，但如果从遗传流行病的角度来看，这可能是由于心肌本身的保护机制抵消了酒精的影响［3］。当酒精影响到肝脏时，会出现脂肪肝或单纯性脂肪变性、酒精性肝炎和伴有肝纤维化或肝硬化的慢性肝炎；影响到心脏时，其病变特点是左心室重量增加、扩张，心室壁变薄和心室功能障碍；影响到骨骼肌时会出现酒精性肌病，肌肉会出现疼痛、萎缩等。酒精性肌病也可称为酒精诱发的肌肉疾病，用于描述由于急性或慢性酒精摄入而引起肌肉的任何病理变化［4］。酒精性肌病的特征是Ⅱ型（无氧）肌纤维选择性萎缩，Ⅰ型（有氧）肌纤维则相对受到保护。目前，不论是慢性酒精中毒，还是急性酒精中毒，其致病机制均涉及骨骼肌蛋白的代谢以及氧化应激［1］。

从数据库中检索到的文献资料显示，有些实验研究集中讨论酒精摄入量与骨骼肌糖原的变化或肌肉损伤程度的关系［5-8］；有些研究则侧重讨论酒精中毒时体内各种炎性因子的改变，比如，人们长期摄入酒精时体内细胞会通过肿瘤坏死因子α（TNF-α）增强泛素/蛋白酶体活性，从而导致蛋白质分解代谢增加；另外，人们长期摄入酒精时会加剧骨骼肌萎缩，使细胞周期调节因子及其受体激活素ⅡB的表达异常，同时改变白介素6（IL-6）的表达［9-11］。JAYASEKARA 等［1］对酒精摄入量和死亡风险之间的关系进行了回顾分析，他们总结了现有证据，与对照组相比，当酒精摄入量超过40 g/d时，酗酒者的死亡风险与摄入量间存在明显的线性关系；ADAMS等［12］的回顾分析以酒精中毒患者为研究对象，系统回顾了细胞因子与酒精滥用之间的关系，酗酒会造成外周血中细胞因子紊乱，同时指出对照组和患者队列中可能患有慢性炎症性或自身免疫性疾病，这将影响细胞因子的产生，使得他们的研究存在高偏倚风险。酒精中毒对骨肌的影响不仅体现在炎性因子的改变，还会引起严重的氧化应激。

1 资料与方法

1.1 纳入标准 （1）研究类型为动物干预研究（animal intervention studies）；（2）研究对象为实验鼠；（3）实验组模型构建方式为酒精喂养或酒精腹腔注射，对照组为空白或安慰剂；（4）研究文献为全文文献，语种为中文、英文；（5）对署名为同一作者或来自同一单位的实质内容重复的文献，仅选择其中1篇文献纳入研究；（6）主要结局指标：氧化应激标志物包括谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）；炎性细胞因子：胰岛素样生长因子1（insulinlike growth factor 1，IGF-1）mRNA、IL-6 mRNA。

1.2 排除标准 （1）研究对象为人；（2）病例报告；（3）非原创（即评论、致编辑的信函、专家意见等）；（4）重复文献；（5）无法获得的文献；（6）描述酒精有关神经病变的文献；（7）未提供相关结局指标或结局指标无法提取。

1.3 文献检索范围及检索策略 依照Cochrane干预措施系统评价手册5.1版［13］要求制定检索策略：采用主题词与自由词结合的检索方法，使用计算机检索维普网（VIP）、万方数据知识服务平台（Wanfang Data）、中国知网（CNKI）、Web of Science、PubMed、Embase、Cochrane Library，所有数据库的检索时间为1990-02-01至2021-08-31。中文检索词包括酒精性肌病，IGF-1 mRNA，IL-6 mRNA，MDA，GSH；英文检索词包括Alcoholic myopath，IGF-1 mRNA，IL-6 mRNA，MDA，GSH，non-alcoholic，liver disease，rhabdomyolysis，Musculoskeletal diseases。

1.4 文献的方法学质量评价 本研究采用SYRCLE动物实验偏倚风险评估工具［10］对文献质量进行评价，该工具包含10个条目，22个附加的信号问题，评价涉及选择偏差、表现偏差、检测偏差、损耗偏差、报告偏差和其他偏差。10个条目分别为：分配序列生成或应用是否足够；各基线是否相同或是否调整了潜在混杂因素；分配隐藏是否足够；实验过程中动物是否被随机分配；是否对研究者和动物饲养者施盲；结果评价中是否经过随机选择；是否对结果评价者采用盲法；不完整的数据是否被报告；研究报告是否与选择性结果报告无关；是否不存在其他偏倚。评价结果以Low risk（L）、Unclear risk（U）和High risk（H）分别代表低偏倚风险、不确定偏倚风险和高偏倚风险［10］。

1.5 资料提取 由2名研究员分别下载文献、整理文献，两名研究员按照纳入、排除标准独立进行文献阅读和资料提取。首先评估标题和摘要，排除明显不相关的研究后由研究员阅读全文后提取相关资料，并交由第3名研究员审核。对存在争议的部分，用以下方法解决：小组讨论、第三方仲裁及专家咨询。若所需资料在文献中未提及，尽可能与原作者取得联系并获得。提取资料的内容包括：第一作者、发表时间、实验鼠类型、分组方式、样本量（实验组、对照组实验鼠只数）、建模方式、饲养时间、取材部位、结局指标、分配隐藏、随机序列生成、盲法（单盲或双盲、评估者的盲法）、缺失数据、选择性报告和其他偏差等。

1.6 统计学方法 采用RevMan 5.4.1 软件进行Meta分析。计量资料统计量采用加权均数差（weighted mean difference，WMD）、标准化均数差（standard mean difference，SMD）及其95%置信区间（confidence interval，CI）分析；计数资料采用RR及其95%CI表示。对纳入文献采用I2和P值进行异质性检验，若I2≤50%且P≥0.1，则表示各研究间统计学异质性较小，采用固定效应模型进行Meta分析；若I2＞50%且P＜0.1，表示纳入的研究间存在统计学异质性，选用随机效应模型进行Meta分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 文献检索结果 初步检索到的文献共771篇，其中中文文献59篇，经过阅读、筛选，排除综述13篇、研究低血钾肌病2篇、信函1篇、非目标数据源文献25篇、非中文或英文文献6篇。最终纳入17篇文献［9-11，14-27］。文献检索流程见图 1。

图1 文献筛选流程图Figure 1 Flow diagram of literature screening

2.2 纳入文献基本特征 本研究共纳入17篇动物干预研究［9-11，14-27］，共包括332只实验鼠，研究对象均是大鼠或小鼠。纳入研究建立实验鼠酒精中毒模型的方式分为急性和慢性两种。慢性酒精中毒建模方法：实验动物在恒温下饲养并暴露于12 h∶12 h的明暗循环，经过1～2周的隔离饲养，给实验组动物的固体或流质食物中逐渐添加酒精至目标浓度（20%、30%、35%、36%、37%或56%），观察疗程为：4～35周；急性酒精中毒建模方法：经腹腔注射乙醇浓度为75 mmol/kg，观察时间为注射乙醇后2.5 h，见表1。

表1 纳入文献的基本特征Table 1 Basic characteristics of the included literature

2.3 纳入文献质量评价 纳入文献整体质量良好，有部分选择偏倚。（1）随机分配方法：只有4项研究［10，21-22，27］提及随机分组，但没有描述具体的随机分组方法。（2）分配方案隐藏：研究均未分配隐藏。（3）研究结局盲法评价情况：研究均未对研究结局进行盲法评价。（4）结局数据的完整性：研究的结局数据均具有完整性。（5）选择性报告研究结果情况：研究均未选择性报告研究结局。（6）其他偏倚来源：研究均未提及其他偏倚情况。纳入研究偏倚风险评价见图 2，偏倚风险总结见图 3（彩图请扫描正文首页二维码）。

图2 偏倚风险评价Figure 2 Assessment of risk of bias

图3 纳入研究的偏倚风险评价结果Figure 3 Assessment summary of risk of bias of included studies

2.4 Meta分析结果

2.4.1 IGF-1 mRNA表达水平 共6篇文献［14-15，17，21-22，24］检测了肌肉组织中IGF-1 mRNA表达水平，各研究间存在异质性（I2=93%，P＜0.000 01），采用随机效应模型进行分析，结果显示实验组IGF-1 mRNA的表达水平低于对照组，差异有统计学意义〔SMD=-3.09，95%CI（-5.75，-0.43），P=0.02〕。进一步进行亚组分析，探索异质性来源，以采样部位作为分组依据，分为两个亚组进行亚组分析，结果显示腓肠肌亚组研究异质性低（I2=0%，P＜0.000 01）。实验组IGF-1 mRNA的表达水平低于对照组，差异有统计学意义〔SMD=-5.21，95%CI（-6.25，-4.17），P＜0.000 01〕；跖肌亚组实验组和对照组IGF-1 mRNA表达水平比较，差异无统计学意义〔SMD=0.85，95%CI（-3.20，4.90），P=0.68〕，亚组分析显示，采样部位可能是异质性主要来源，见图 4。

图4 IGF-1 mRNA表达水平亚组分析森林图（腓肠肌和跖肌亚组）Figure 4 Forest plot of subgroup analysis of IGF-1 mRNA expression levels （gastrocnemius and plantaris）

2.4.2 IL-6 mRNA 表达水平 5 篇文献［10-11，17，21-22］研究了模型鼠酒精性肌病IL-6 mRNA表达情况，研究之间异质性较低（I2=41%，P=0.15），采用固定效应模型进行Meta分析。结果显示，实验组IL-6 mRNA表达水平高于对照组，差异有统计学意义〔SMD=3.75，95%CI（2.93，4.57），P＜0.000 01〕，见图 5。

图5 IL-6 mRNA表达水平森林图Figure 5 Forest plot of IL-6 mRNA expression levels

2.4.3 MDA 7 篇文献［9，18-20，23，25-26］报道了 MDA，但是WANG等［18］的研究从比目鱼肌和跖肌这个两部位取材，同时测定了MDA，有2项数据。异质性检验结果提示纳入研究间无异质性（I2=0%，P=0.93），采用固定效应模型进行Meta分析，结果显示实验组MDA高于对照组，差异有统计学意义〔SMD=0.92，95%CI（0.63，1.22），P＜0.000 01〕，见图 6。

图6 MDA水平森林图Figure 6 Forest plot of subgroup analysis of the levels of MDA

2.4.4 GSH 6篇文献，7项研究报道了 GSH［11，16-19，27］，研究间存在异质性（I2=93%，P＜0.000 01），使用随机效应模型进行分析，结果显示实验组GSH低于对照组，差异有统计学意义〔SMD=-4.20，95%CI（-6.24，-2.17），P＜0.000 01〕。进一步进行亚组分析，探索异质性来源，按采样部位将纳入的研究分为跖肌亚组和比目鱼肌亚组，结果显示亚组内依然存在异质性（I2=91%，P＜0.000 01）。跖肌亚组中实验组GSH低于对照组，差异有统计学意义〔SMD=-5.08，95%CI（-8.01，-2.14），P=0.000 7〕；比目鱼肌亚组中实验组和对照组GSH比较，差异无统计学意义〔SMD=-2.91，95%CI（-9.27，3.45），P=0.37〕，取样部位不是其异质性来源，见图7。

图7 GSH水平亚组分析森林图（跖肌组和比目鱼组）Figure 7 Forest plot of subgroup analysis of the levels of GSH（plantaris and soleus）

将建模时使用的酒精浓度作为分组依据进行亚组分析，酒精浓度20%～36%为A组，酒精浓度＞36%～56%为B组。亚组分析结果显示，A组异质性降低（I2=58%，P=0.07），其实验组GSH低于对照组，差异有统计学意义〔SMD=-5.91，95%CI（-8.32，-3.49），P＜0.000 01〕；B组异质性依然校高（I2=95%，P＜0.000 01），其实验组实验组与对照组GSH比较，差异无统计学意义〔SMD=-2.33，95%CI（-4.70，0.04），P=0.05）〕。亚组分析显示建模时酒精浓度可能为部分异质性的来源，见图8。

图8 GSH水平亚组分析森林图（A组酒精浓度范围：20%～36%；B组酒精浓度范围：＞36%～56%）Figure 8 Forest plot of subgroup analysis of levels of GSH（A：alcohol concentration range 20%～36%；B：alcohol concentration range＞36%～56%）

3 讨论

酗酒者可以出现多处器官损伤，从营养不良到明显的肝损伤，如终末期肝硬化，医务工作者关注酒精引起的肝损伤却容易忽视其引起的骨骼肌病变。由酒精诱发的肌肉疾病称为酒精性肌病，其包括急性酒精性肌病，约占酗酒者的1%，其特征是肌肉出现急性肿胀疼痛；慢性酒精性肌病是酒精中毒的常见并发症，约占酗酒者的50%，受影响患者表现为近端肌肉无力［4］，其机制为长期饮酒会降低Ⅱ型肌纤维的肌肉（如腓肠肌和/或跖肌）蛋白质含量和蛋白质合成［28］。同时，酒精性肌病的特点是出现炎症，氧化应激等。在早期，酒精引起的肌肉疾病较少受到人们的关注［29］。而事实上，酒精诱发的肌病发病率是常见的遗传性肌病（即肾上腺肌病）的10倍。通过检索发现针对上述酒精性肌病的荟萃分析暂有空缺。因此本文将选择多个炎性因子和氧化应激标志物，采用Meta分析的方式对酒精中毒动物模型的研究做出系统评价，以探讨炎性因子和氧化应激标志物在酒精性肌病基础研究和临床研究中的应用价值。

本研究纳入17篇文献，Meta分析结果提示，以IGF-1 mRNA作为指标时，共纳入6项研究［14-15，17，21-22，24］，被纳入研究之间异质性较大，进行亚组分析后显示腓肠肌亚组异质性低，在酒精中毒后肌肉中的IGF-1 mRNA表达水平明显下降，跖肌亚组仍存在较高异质性，通过森林图中的数据发现异质性来源于OTIS等［17］在2009年的研究，该研究测得实验组跖肌中IGF-1 mRNA表达水平高于对照组，与同时纳入的其他研究有差异。可能的原因是，当肌肉发生慢性酒精中毒时，IGF-1显著降低［30］。LANG 等［15］用 IGF-1和 IGF结合蛋白3（IGFBP-3）组成的二元复合物处理酒精中毒的大鼠时，其体内的真核翻译起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1） 磷酸化仍然降低，表明人为地增加IGF-1以及相关蛋白无法改变大鼠肌肉萎缩的事实。这一研究说明，IGF-1 mRNA的表达水平与酒精中毒没有直接关系。这可能是IGF-1 mRNA作为指标时研究之间异质性较大的原因。另外，所有以IGF-1 mRNA为指标的研究中只有OTIS等［17］的建模时间长达35周，长时间的酒精喂养可以使得IGF-1 mRNA在肌肉中的表达形成了新的平衡。BORRISSER-PAIRÓ等［31］在2013年对酒精中毒患者的研究也证实了IGF-1表达量在慢性酒精中毒患者体内只是略微下降，但是没有统计学意义（P=0.069）。因此在以后的研究中，如果将IGF-1 mRNA作为指标，既要谨慎地选择样本来源，又要妥善选择建模时间。

MDA是自由基反应产生的主要降解产物，故MDA可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映细胞氧化应激的程度。纳入的 7 项研究［9，18-20，23，25-26］，实验组与对照组相比，MDA平均提高了约0.9倍，实验组MDA水平均高于对照组。HUANG等［32］指出，过量饮酒可以导致人体内MDA水平升高。MDA水平不仅反映了脂质过氧化水平，其与线粒体氧化磷酸化的损害也有关。在酒精性肌病患者体内，MDA与蛋白质形成加合物，通过引起膜磷脂过氧化而发挥细胞毒性作用，增加膜通透性并损害膜功能，最终损伤肌细胞［33］。IL-6是白介素的一种，其作为促炎细胞因子和抗炎性肌球蛋白起作用。以IL-6 mRNA作为指标时，纳入5项研究［10-11，17，21-22］，实验组IL-6 mRNA表达量均高于对照组，这一结果与GONZÁLEZ-REIMERS等［34］的临床研究一致。IL-6 mRNA、MDA作为结局指标时，各研究之间异质性较小，且各研究中实验组与对照组之间差异是有统计学意义的。因此使用它们作为标志物时，有较强稳定性，而且动物实验结果与临床研究结果有一致性。当使用GSH作为结局标志物时，异质性检验显示各研究之间有很大的异质性。酒精中毒后的组织损伤可能是由于活性氧（ROS）产生增加所致，DEKEYSER等［11］和OTIS等［16］的研究均支持Ⅱ型肌纤维中对酒精引起的氧化还原状态的改变特别敏感，其原因是Ⅱ型肌肉中的GSH水平较低，存量不足、消耗增加使得GSH水平出现明显下降，导致Ⅱ型肌纤维无法拮抗ROS对肌纤维的损害。WANG等［18］和初海鹰等［19］的研究均使用了以粮食为原料的酿造食用酒（56%）作为建模手段。粮食酿造的食用酒与单纯的酒精存在区别，以粮食为原料酿造的酒中含有多种微量元素，这些元素可能对实验结果产生影响。一项研究也证实了在酿酒的过程中确实会产生很多抗氧化物质［35］。

综上所述，尽管骨骼肌萎缩时与体内IGF-1水平下降有某种关联，并不建议将IGF-1或IGF-1 mRNA作为研究酒精性肌病的指标，或者应该谨慎考虑其价值。MDA和GSH均与氧化应激有关，且能较准确反映出酒精中毒时肌肉的局部的氧化压力，是非常稳定有价值的标志物。但是在使用GSH的时候，一定要关注实验动物的分组方法、酒精的类型及建模酒精的浓度，这样才能得出稳定且科学的结论。

本研究存在以下的问题：（1）在建模方式和取样部位存在差异：本研究共纳入17项研究中，酒精的固体饲料喂养和酒精的液体饲养都使用的是统一的标准，但是酒精中毒模型鼠的建模方法各不相同，可能会造成偏倚，其中有4项研究没有详细注明取材部位，只说明取材于骨骼肌；（2）纳入研究的方法学质量不高：纳入的17项研究中仅4项研究报道使用了随机分组方法，整体研究质量评价倾向于偏倚风险未知，可能对Meta分析结果产生影响，提示未来仍需开展方法学质量较高的动物干预实验及临床试验来研究酒精性肌病的机制。

作者贡献：汪楠、Oleksandr Motuziuk进行文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析，结果的分析与解释，撰写论文；汪楠、Oleksandr Motuziuk、Iryna Mishchenko进行数据收集；周颖婷进行数据整理；汪楠进行统计学处理；Oleksandr Motuziuk进行论文的修订，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。