玉米秸秆还田量对砂姜黑土酶活性、微生物生物量及细菌群落的影响

刘高远，和爱玲，杜君，杨占平，潘秀燕，许纪东，郑念，张玉亭*

（1.河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所，郑州 450002；2.遂平县农业科学试验站，河南 驻马店 463100）

土壤生物学特性是评价土壤肥力的敏感性指标。其中，土壤酶和微生物是土壤生物学特性的重要组成部分，二者共同参与多种重要的生物化学过程，在养分转化循环、有机质分解、污染物降解等方面发挥着关键作用[1]。秸秆中含有丰富的有机碳及营养元素，秸秆还田能够激发土壤酶及微生物活性，进而促进秸秆降解及养分释放[2]。因此，明确秸秆还田条件下土壤酶及微生物变化特征对构建良好的土壤微生态环境具有重要意义。

秸秆还田量是影响土壤酶及微生物活性的重要因素。WU 等[2]和ZHAO 等[3]的研究已证实，适宜的秸秆还田量能够提高土壤酶活性、微生物生物量及微生物群落丰度。但受气候、土壤类型的制约，不同生态区适宜秸秆还田量存在明显的差异[4-7]。秸秆还田量不合理不仅直接影响土壤理化性质，而且也影响土壤酶及微生物活性水平。ZHAO 等[8]发现，玉米秸秆还田量为4 500 kg·hm-2和9 000 kg·hm-2时，显著提高了土壤酶（β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶等）活性、革兰氏阴性细菌丰度及真菌丰度，但两个还田量处理土壤酶活性及微生物群落丰度无显著差异。高日平等[4]发现，玉米秸秆还田量3 000～12 000 kg·hm-2条件下，6 000 kg·hm-2处理显著提高了土壤微生物（细菌、真菌及放线菌）数量及土壤酶（蔗糖酶、脲酶及过氧化氢酶）活性。此外，秸秆还田量过高还会造成下茬作物出苗率降低、病虫害加重[9]、温室气体排放量增加[10]等生产及环境问题。

砂姜黑土是黄淮海平原重要的农耕土壤，具有肥力水平低、透水透气性差等特性，属于典型的中低产土壤类型。秸秆还田仍是该土壤类型区小麦-玉米轮作制度下最重要的土壤培肥措施之一。然而，在该土壤类型区，关于秸秆还田的研究多集中在土壤理化性质方面[7，11]，缺乏土壤生物学特性方面的研究，尤其是土壤养分、酶活性等环境因子与微生物之间的互作关系仍需要进一步研究。因此，本研究以黄淮海平原砂姜黑土区小麦-玉米轮作为例，研究不同玉米秸秆还田量对土壤酶活性、微生物生物量及细菌群落的影响，结合土壤养分状况，分析土壤细菌群落组成与环境因子的关系，从生物学角度探讨土壤适宜的玉米秸秆承载力，为该土壤类型区秸秆资源合理利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2019—2021 年在河南省驻马店市遂平县农业科学试验站（113°97′E，33°15′N）开展。该地区属暖温带大陆性季风气候，年均气温14.9 ℃，年均降雨量972 mm，年均蒸发量1 574 mm，无霜期220 d。土壤类型为石灰性砂姜黑土，0～50 cm 土质为黏壤土及壤质黏土，耕层质地黏重，适耕期较短。试验前，0～20 cm 土层基本性质：容重1.44 g·cm-3，有机碳7.8 g·kg-1，全氮0.11 g·kg-1，有效磷7.9 mg·kg-1，速效钾134.2 mg·kg-1，pH 6.7。

1.2 试验设计

试验设置0、1∕3、2∕3 和100%玉米秸秆还田量（CK、S3、S6 和S9），4 个处理，3 次重复，共12 个小区，小区面积40 m（28 m×5 m），完全随机排列。CK、S3、S6 和S9 处理还田量分别为0、3 000、6 000 kg·hm-2和9 000 kg·hm-2。秸秆自然风干，粉碎至5 cm 左右，于小麦播种前按小区需求量旋耕翻入0～20 cm 土层。秸秆氮、磷和钾含量分别为2.12%、0.24%和2.43%。小麦品种为遂麦139（遂平县农业科学试验站选育），播种量180 kg·hm-2，当年10 月下旬播种，翌年6 月上旬收获。肥料品种与施肥量：肥料品种为尿素（含N 46%）、过磷酸钙（含P2O512%）和氯化钾（含K2O 60%），N、P2O5和K2O用量分别为180、100、60 kg·hm-2，其中磷、钾肥和70%氮肥于小麦播种前基施，30%氮肥于拔节期追施。小麦收获后，秸秆全量（7 500 kg·hm-2左右）覆盖还田，接茬玉米轮作。玉米品种为郑单1002（河南省农业科学院粮食作物研究所），播种与施肥方式为贴茬种肥同播，密度67 500 株·hm-2；肥料选用常规复合肥（N-P2O5-K2O 为30-5-5），施用量750 kg·hm-2，基施、无追肥。整地、病虫草害防治等田间管理措施同当地农户保持一致。

1.3 样品采集与分析

1.3.1 样品采集

于2021 年小麦收获期，采用五点取样法，用5 cm直径的土钻分别采集各小区0～20 cm 土样，混匀，每个土样为各小区5 个采样点的混合样，剔除可见动、植物残体和石块等过2.00 mm 筛备用。将采集的土样分成三部分：一部分自然风干过0.25 mm 筛，用于测定土壤养分含量；另一部分4 ℃保存，7日内测定酶活性及微生物生物量；其余部分-80 ℃保存，3日内分析土壤细菌群落特征。

1.3.2 土壤养分、酶活性及微生物生物量分析

有机碳的测定采用K2Cr2O7-H2SO4氧化法；碱解氮的测定采用碱解扩散法；有效磷的测定采用钼蓝比色法；速效钾的测定采用火焰光度法。土壤养分指标的测定方法均参考《土壤农化分析》[12]。微生物生物量碳、生物量氮的测定采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法[13]。脲酶、纤维素酶、木聚糖酶和漆酶活性的测定采用酶联免疫分析（ELISA）双抗体夹心法，步骤参考ELISA 试剂盒（上海双赢生物科技有限公司）使用说明书。

1.3.3 微生物DNA提取及高通量测序

称取0.5 g 冷冻土样，使用FastDNA®SPIN Kit（MP Biomedicals，法国）提取微生物DNA，采用Nano-Drop2000 分光光度计（Thermo Scientific，美国）检测DNA 浓度和纯度，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，检测合格后，用于构建文库。采用细菌通用引物对16S rRNA基因V3～V4区进行PCR扩增，使用2%琼脂糖凝胶回收扩增产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，美国）纯化，并用QuantiFluorTM-ST（Promega，美国）检测定量。根据Illumina MiSeq 平台（Illumina，美国）标准操作规程，利用纯化后扩增片段构建PE 2×300 文库，采用Illumina Miseq技术测序。

1.4 测序数据处理

测序完成后，对有效序列进行质控、拼接和去杂等处理，12 个样品共得到723 735（46 573～73 118）条高质量序列，平均长度415 bp，用于分析细菌群落特征。基于97%的相似水平，利用UPARSE软件对操作分类单元（OTU）进行聚类，并使用UCHIME 鉴定及去除嵌合序列。根据Silva数据库，对每个OTU物种注释与分类。利用Mothur软件计算Shannon、Simpson多样性指数及Chao1、ACE丰富度指数，用于评价细菌α-多样性[14]；基于Bray-Curtis 距离矩阵进行非度量多维尺度分析（NMDS），用于评价细菌群落结构特征。

1.5 统计分析

利用SPSS 21.0 软件中单因素方差分析法（Oneway ANOVA）比较处理间各指标的差异，采用最小显著性差异法（LSD，P=0.05）比较处理间各指标结果的平均值。采用R 3.60 软件中Vegan 包进行细菌群落结构的NMDS 分析及细菌群落组成与环境因子的冗余分析（RDA），并采用Ggplot2 包绘图。采用Origin-Pro 2021b绘制柱状图。

2 结果与分析

2.1 玉米秸秆还田量对土壤基础养分含量的影响

图1 为不同玉米秸秆还田量处理下土壤有机碳、碱解氮、有效磷和速效钾含量。结果表明，与CK处理相比，S6 和S9 处理显著提高了土壤有机碳（12.9%和14.4%）、碱解氮（21.4%和25.6%）、有效磷（17.9%和20.5%）和速效钾（25.9%和29.8%）含量，而S3 处理土壤养分含量与CK处理无显著差异。在秸秆还田处理中，S6 和S9 处理较S3 处理土壤速效钾含量分别显著提高了12.8%和16.2%，而S6和S9处理各土壤养分含量均无显著差异。

图1 不同处理下土壤养分含量Figure 1 Soil nutrient contents under different treatments

2.2 玉米秸秆还田量对土壤酶活性的影响

表1 为不同玉米秸秆还田量处理下土壤酶活性。结果表明，与CK处理相比，秸秆还田处理显著提高了土壤脲酶和纤维素酶活性，增幅分别为22.5%～44.6%和23.9%～52.1%；同时，S6 和S9 处理较CK 处理显著提高了土壤木聚糖酶活性，增幅分别为32.7%和21.2%；不同处理土壤漆酶活性之间差异不显著。在秸秆还田处理中，S6 和S9 处理较S3 处理土壤纤维素酶活性分别显著提高了22.8%和14.5%，木聚糖酶活性分别显著提高了23.2%和12.5%，而S6和S9处理之间土壤酶活性无显著差异。

表1 不同处理下土壤酶活性（U·g-1）Table 1 Soil enzyme activities under different treatments（U·g-1）

2.3 玉米秸秆还田量对土壤微生物生物量碳、生物量氮的影响

图2 为不同玉米秸秆还田量处理下土壤微生物生物量碳、生物量氮含量。结果表明，与CK 处理相比，秸秆还田处理显著提高了土壤微生物生物量碳，增幅为16.6%～46.7%，S6 处理增幅最高；同时，S6 和S9 处理较CK 处理显著提高了土壤微生物生物量氮，增幅分别为53.5%和54.4%。在秸秆还田处理中，S6和S9处理较S3处理土壤微生物生物量碳分别显著提高了25.9%和23.6%，而S6和S9处理土壤微生物生物量碳、生物量氮之间均无显著差异。

图2 不同处理下土壤微生物生物量碳、生物量氮含量Figure 2 Contents of soil microbial biomass C and N under different treatments

2.4 玉米秸秆还田量对土壤细菌α-多样性的影响

不同玉米秸秆还田量处理下土壤细菌α-多样性特征（表2）表明，与CK 处理相比，秸秆还田处理土壤细菌群落丰富度指数（Chao1 指数和ACE 指数）无显著变化，即秸秆还田对土壤细菌群落丰富度的影响较小。然而，对于土壤细菌群落多样性指数（Shannon指数和Simpson 指数）来说，与CK 处理相比，S6 和S9 处理Shannon 指数显著升高、Simpson 指数显著下降，即2∕3 和100%玉米秸秆还田量均显著提高了土壤细菌群落多样性。由此可见，秸秆还田对土壤细菌群落丰富度影响较小，而增加秸秆还田量一定程度上能够提高土壤细菌群落多样性。

表2 不同处理下土壤细菌α-多样性Table 2 Soil bacterial α-diversity under different treatments

2.5 玉米秸秆还田量对土壤细菌群落结构的影响

对土壤细菌群落在门水平上进行分类，4 个处理共含有30 个门，相对丰度≥1%的门有9 个（图3），其中放线菌门、变形菌门、酸杆菌门、绿弯菌门和厚壁菌门为优势门，相对丰度占87.2%～89.4%。与CK 处理相比，秸秆还田处理下酸杆菌门相对丰度显著降低了2.6～4.7 个百分点，S6 和S9 处理下变形菌门相对丰度分别显著增加了3.8、4.9 个百分点，不同处理下其他细菌门之间相对丰度差异均不显著。进一步对比分析，4 个处理共含有637 个属，其中热酸菌属、布氏杆菌属和芽孢杆菌属为优势属（图4）。与CK 处理相比，秸秆还田处理下芽孢杆菌属相对丰度显著提高了1.2～2.9 个百分点，S6 和S9 处理下布氏杆菌属相对丰度分别显著降低了1.4和1.8个百分点，不同处理下热酸菌属相对丰度差异不显著。

图3 不同处理下土壤细菌群落在门水平上的相对丰度Figure 3 Soil bacterial community abundance at phylum level under different treatments

图4 不同处理下土壤优势细菌属的相对丰度Figure 4 The abundance of soil predominant bacterial genera under different treatments

不同玉米秸秆还田量处理下土壤细菌群落结构在OTU 水平上的非度量多维尺度分析（NMDS）结果（图5）表明，与CK 处理相比，秸秆还田处理明显影响了土壤细菌群落组成，并形成了不同的群落空间结构。其中，S6 和S9 处理土壤细菌群落空间结构变化趋势较为一致，且与CK处理差异较大。

图5 不同处理下土壤细菌群落结构在OTU水平上的非度量多维尺度分析（NMDS）Figure 5 The NMDS of soil bacterial community structure at OTU level under different treatments

2.6 土壤细菌群落组成与环境因子之间的关系

图6 为不同玉米秸秆还田量处理下土壤细菌群落组成与环境因子的RDA 结果，两个排序轴共解释了81.8%土壤细菌群落组成的差异。其中，第一排序轴贡献率为69.2%且显著（F=13.93，P＜0.05）影响了土壤细菌群落组成，主要反映了土壤细菌群落组成受有机碳（F=6.42，P＜0.05）、微生物生物量碳（F=5.51，P＜0.05）和脲酶（F=4.85，P＜0.05）的影响，其解释率依次为59.8%、50.1%和43.4%；第二排序轴贡献率仅为12.6%，主要反映了碱解氮和有效磷对土壤细菌群落组成的影响。由此可见，土壤有机碳、微生物生物量碳和脲酶是影响土壤细菌群落组成的关键因子。

图6 不同处理下土壤细菌群落组成与环境因子的冗余分析Figure 6 The RDA of soil bacterial community composition and environmental factors under different treatments

3 讨论

3.1 土壤基础养分变化特征

秸秆还田是改善土壤养分状况的有效措施[15]。本研究发现，与CK 处理相比，S6 和S9 处理显著提高了土壤有机碳、碱解氮、有效磷及速效钾含量，而S3处理土壤养分含量无显著变化，这与ZHANG 等[16]的研究结果一致，其原因归结于高量或中量秸秆还田条件下大量秸秆发生腐解，使养分释放量增加。然而，当秸秆还田量超出一定范围后，秸秆腐解率会随着投入量的增加而降低，土壤养分含量呈现下降趋势[17]。在本研究中，S6 与S9 处理之间土壤养分含量均无显著差异，说明100%秸秆还田量（9 000 kg·hm-2）未对土壤养分造成不良影响。

3.2 土壤酶活性变化特征

土壤酶活性是表征土壤养分循环及微生物代谢活性的关键指标[18]。其中，脲酶和纤维素酶是参与土壤碳、氮循环的主要酶系，其活性与纤维素降解密切相关[19]。程曼等[20]研究发现，长期秸秆还田显著提高了土壤脲酶和纤维素酶活性。WEI等[21]也发现，秸秆还田条件下土壤脲酶、转化酶等活性显著增加，并指出土壤酶活性与有机质含量呈显著正相关。在本研究中，秸秆还田处理显著提高了土壤脲酶和纤维素酶活性，这可能与大量碳源投入引起的土壤有机质增加、微生物生长与活性增强及微生物群落变化有关[22-23]。木聚糖酶是降解半纤维素的主要酶系，其活性与微生物降解半纤维素能力相关。贺美等[24]研究发现，与不还田和1∕3 秸秆还田量（3 000 kg·hm-2）相比，1∕2（4 500 kg·hm-2）和100%秸秆还田量（9 000 kg·hm-2）均显著提高了土壤木聚糖酶活性，本研究也得到了相似的结论（表1）。漆酶是降解木质素的关键酶系，其活性与微生物降解木质素能力相关。在本研究中，秸秆还田处理土壤漆酶活性无显著变化，这一方面可能与秸秆木质素结构复杂、降解慢等特性有关；另一方面可能与该土壤类型下产漆酶微生物（白腐菌、褐腐菌等）较少有关[25]。此外，有研究表明，适宜秸秆还田量能够显著提高土壤酶（脲酶、转化酶等）活性，而秸秆还田量过高造成了土壤酶活性大幅下降[4]。本研究发现，S6 和S9 处理4 种土壤酶活性之间均无显著差异，说明100%秸秆还田量（9 000 kg·hm-2）未对土壤酶活性造成不良影响。

3.3 土壤微生物生物量碳、生物量氮变化特征

土壤微生物生物量是土壤活性养分的储存库，反映了参与调控土壤养分循环的微生物数量[26]。有报道指出，有机物料的投入为土壤微生物提供了大量碳源，刺激了土壤微生物生长繁殖及作物生长，提高了土壤微生物生物量[27]，这与本研究中S6 和S9 处理土壤微生物生物量碳、生物量氮含量均显著高于CK 处理的结果基本一致，可能是由于S6 和S9 处理下土壤有机碳及其他养分含量较高（图1）。相比之下，S3 处理秸秆还田量相对较低，导致土壤微生物生物量的变化相对较小。

3.4 土壤细菌群落结构多样性特征

土壤微生物是评价土壤生物学特性的关键指标[28]。张鑫等[29]研究发现，秸秆还田能够维持和提高土壤细菌群落多样性水平，本研究也得到了相似的结果（表2）。在本研究中，酸杆菌门相对丰度在秸秆还田处理下显著降低，变形菌门相对丰度在S6 和S9 处理下均显著增加，这可能是由于酸杆菌门属于贫营养型菌，生长速率缓慢，易富集在养分含量较低环境中，能够降解复杂的有机物质[30]；然而，变形菌门属于富营养型菌，能够在土壤有机质及营养元素较高环境条件下迅速生长[31]。进一步分析发现，芽孢杆菌属相对丰度在秸秆还田处理中显著提高，布氏杆菌属相对丰度在S6 和S9 处理下均显著降低，这主要是由于芽孢杆菌属是厚壁菌门下主要化能异养细菌类群，参与木质纤维素降解、难溶性养分转化等过程，其丰度与土壤有机碳及速效养分含量呈极显著正相关[32]；然而，布氏杆菌属是酸杆菌门下主要异养细菌类群，其生长特性及规律与酸杆菌门细菌相似[33]。本研究NMDS结果表明，与CK 处理相比，S6 和S9 处理下土壤细菌群落结构均发生了明显的变化，其根本原因在于处理间土壤养分含量、酶活性及微生物生物量的差异影响了土壤细菌群落结构分布。由此可见，与不还田相比，2∕3（6 000 kg·hm-2）和100%秸秆还田量（9 000 kg·hm-2）在改善土壤细菌群落结构与多样性方面均具有积极作用。

3.5 影响土壤细菌群落组成的关键因子

有研究表明，土壤有机质、微生物生物量碳、脲酶活性与微生物碳利用率呈显著正相关[34]。本研究RDA 结果表明，土壤有机碳、微生物生物量碳及脲酶是影响土壤细菌群落组成的关键因子。该结果说明土壤有机碳含量、微生物生物量碳含量及脲酶活性越高越有利于细菌生长，进而提高土壤有机碳并改善土壤生物学特性。

4 结论

与玉米秸秆不还田相比，2∕3（6 000 kg·hm-2）和100%玉米秸秆还田量（9 000 kg·hm-2）均能够提高砂姜黑土土壤养分含量，增强土壤脲酶、纤维素酶和木聚糖酶活性，提高土壤微生物生物量碳、生物量氮含量，改善土壤细菌群落结构；相比之下，1∕3 玉米秸秆还田量（3 000 kg·hm-2）的作用效果相对较弱。

因此，在砂姜黑土区，2∕3（6 000 kg·hm-2）和100%玉米秸秆还田量（9 000 kg·hm-2）均能够改善土壤养分状况及生物学特性，可根据当地情况选择适宜用量。