烟草抗冷相关基因在两种不同育苗方式下的低温应答差异分析

陈千思，方 明，李泽锋，刘金燕，周会娜，侯建林，李 军，吴文信，李思军

1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001 2.湖南省烟草公司郴州市公司，湖南省郴州市北湖区燕泉北路61号 423000

漂浮育苗技术具有育苗成本低、质量好和产量高的优点，是我国烟草生产中采用的一种主要育苗方式［1-3］，但该方法存在抗逆抗病性差、苗期延长和根系发育迟缓等问题［4］。在我国南方的部分烟区，烟苗移栽前后气温偏低、光照不足，故这些问题尤为明显［5］。湘南烟区在漂浮育苗技术的基础上通过长期实践探索发展出水旱两段式育苗技术，该技术能显著促进烤烟苗期不定根的生长，提高壮苗率、缩短缓苗期、提高成苗质量，还能有效降低倒春寒的低温天气对烤烟苗期生长的不利影响，提高其在低温胁迫下的成活率和抗逆性［1，6-8］，在湖南郴州、永州等烟区得到了大面积推广。

低温是限制植物生长的主要环境胁迫之一，可导致植物细胞膜固化，破坏蛋白质复合物的稳定性并影响光合作用，导致作物减产［9］。植物通过激活相关的低温响应基因，调节脂质组成、糖和可溶性蛋白含量、植物激素水平来适应低温环境［10-11］。其中CBF转录因子又称为脱水响应元件结合蛋白1（Dehydration Responsive Element Binding 1，DREB1），在高等植物冷驯化中发挥关键作用［12］。CBF家族成员CBF1～CBF3串联排列在拟南芥基因组第4号染色体的8.7 kb区域［13］，Maruyama等［14］发现CBF1基因表达受低温胁迫诱导，过表达CBF1基因的拟南芥植株具有较强的抗冻性。Gilmour等［15］发现过表达CBF3基因的转基因植株具有更高的干旱、盐和冰冻胁迫耐受性。此外，一些冷诱导相关转录因子与CBF类似，它们在低温胁迫下诱导COR基因的表达，从而提高植物的耐寒性［16］。目前的CBF通路模型为CBF1～CBF3响应低温快速诱导，随后CBF靶向基因CBF-regulon的表达发生改变，抗冻性提高［17］。研究表明，多个CBF-regulon转录因子受First wave基因（如HSFC1、ZAT12、ZAT10、ZF和CZF）的诱导，其中HSFC1、ZAT12、ZF和CZF基因可独立于CBF途径启动植物抗低温应答［18］。NtbHLH123转录因子可激活NtCBF、活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）清除相关基因（NtAPX、NtSOD和NtCAT）和胁迫应答基因（NtLEA5、NtERD10C和NtERD10D），作为抗低温的正调节因子，提高烟草抗冻性［19］。然而，目前水旱两段式育苗方式提高烟苗抗低温胁迫能力的分子机制尚不明确。为此，基于实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）技术，系统分析两种育苗方式（水旱两段式育苗和漂浮式育苗）烟草CBF和抗冷相关转录因子基因在低温胁迫下的表达模式差异，旨在筛选烟草受低温响应的关键转录因子，明确两种育苗方式在低温胁迫下的响应模式差异，为阐明水旱两段式育苗提高烟草抗低温能力的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

试剂：EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒（Lot No.RN3802，北京艾德莱生物科技有限公司）；反转录试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Lot No.04897030001）和qRT-PCR试剂 盒FastStart Essential DNA Green Master（Lot No.06924204001）（瑞士罗氏公司）。

仪 器：LightCycler 96实时 定 量PCR仪（Lot No.05815916001，瑞士罗氏公司），劲力冷藏柜（Lot No.G1000LSF，中山市劲力冷冻设备制造有限公司）。

引物合成：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 烟草材料种植

实验材料按照湖南省烟草公司郴州市公司《烤烟水旱两段式育苗技术规程》［Q/CZYC-J-ZD-JS-02（2018）］和《烤 烟 漂 浮 育 苗 技 术 规 程》［Q/CZYC-J-ZD-JS-01（2018）］进行育苗。育苗在国家烟草基因研究中心温室进行，温度25℃，相对湿度40%，光周期为16 h光照/8 h黑暗。

1.2.2低温处理和样品采集

实验设置4组处理（漂浮式育苗、水旱两段式育苗、冷处理漂浮式育苗、冷处理水旱两段式育苗），3次生物学重复，每个重复至少6株。每株取顶部的第3和第4片真叶，取样后液氮速冻，-80℃保存。冷处理流程：在烟苗长至八叶一心（约60 d）时，对烟苗进行低温（模拟冷害）处理，时长为3 h，温度为4℃，相对湿度为95%，低温处理后转移至室温，16 h光照/8 h黑暗交替条件下生长，不使用化学调控剂。

此模块包括学校人事档案信息管理、教学档案信息管理、科研项目与成果档案信息管理、各职能部门相关政策文件档案信息管理等子系统。各类档案数据信息都以相对独立又可通过关联字段相互关联的关系数据库文件形式存在，其数据库结构由前述各职能部门的管理信息系统结构设计时一并形成，其库中数据多由前述各子系统运行中自动归档而成，也有部分由本模块管理员依据实情审核后上传。

1.2.3 烟草中CBF基因家族

根据文献［13，20-23］选取拟南芥（Arabidopsis thaliana）CBF基因及其蛋白序列，并参考Zhao等［19］的方法，选取烟草CBF基因及其蛋白序列（ftp：//ftp.solgenomics.net/genomes/Nicotiana_tabacum/）。

利用TBtools软件（https：//github.com/CJ-Chen/TBtools/releases）对获得的烟草CBF蛋白的氨基酸序列进行比对。

1.2.4 烟草中CBF基因系统发育分析

使用ClustalX V2.0软件并用其默认参数对筛选出的烟草CBF基因的氨基酸序列与拟南芥CBF基因的氨基酸序列进行CBF蛋白的多序列比对。

使用MEGA 7.0软 件，采 用邻 近 法（NJ，Neighbor-Joining method）构建系统发育进化树，采用p-distance模型，校验参数（Bootstrap）设置为1 000，其余均为默认参数。

1.2.5 烟草中CBF基因结构分析

使用在线基因结构显示软件Gene Structure Display Server v2.0（GSDS：http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）绘制烟草CBF基因家族基因的内含子-外显子结构显示图。利用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）在线分析软件，使用默认参数查询、分析由烟草CBF基因编码的蛋白质中的保守结构域，使用TBtools软件绘制保守结构域图。

1.2.6 烟草中CBF基因启动子顺式作用元件分析

提取CBF基因上游2 000 bp，利用在线工具PlantCARE对顺式作用元件进行搜索鉴定（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）［24］。其中，NtCBF1上游序列过短，未开展相关分析。

1.2.7 烟草中抗冷相关基因qRT-PCR分析

对冷处理前后两种育苗方式烟草中CBF、CBF-regulon相关基因及非CBF-regulon相关基因等抗冷相关基因进行qRT-PCR分析。将1.2.2节中采集的样品用液氮冷冻研磨成粉末，使用植物RNA快速提取试剂盒和反转录试剂盒进行RNA抽提和反转录，将反转录的cDNA稀释至400 ng/μL。选取基因特异引物［19］（表1），利用qRT-PCR方法，取1 μLcDNA用于基因定量分析的模板，用烟草EF1α基因（GenBank ID：NM001326165）作为内参，3次技术重复。依照qRT-PCR试剂盒说明书的操作步骤和反应程序，使用qRT-PCR仪对抗冷相关基因进行定量分析。数据分析采用2-ΔΔCT方法进行，并进行3次生物学重复。利用GraphPad软件（Version 9.3.0）绘制实时柱形图，并分析显著性。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

表1 （续）

2 结果与讨论

2.1 烟草CBF基因家族的结构特征、保守结构域及启动子顺式作用元件分析

对烟草的21个CBF基因和拟南芥的6个CBF基因的全长氨基酸序列进行了多重序列比对，并构建进化树，结果表明，烟草NtCBF15、NtCBF16、NtCBF17、NtCBF18、NtCBF19、NtCBF20和NtCBF21基因与拟南芥的CBF5和CBF6基因进化关系较近，而其余的烟草CBF基因则与拟南芥CBF1、CBF2、CBF3和CBF4基因进化关系相近（图1）。为研究烟草CBF基因家族成员的基因结构，分析了烟草CBF基因家族的外显子/内含子结构和保守基序，结果表明烟草CBF家族成员中除了NtCBF14基因含有一个内含子和两个外显子以外，其余成员均只含有一个外显子（图1）。

比较分析烟草CBF基因的全长蛋白质序列，确定蛋白结构域。结果显示，烟草CBF基因家族的所有成员均具有Motif 1、Motif 2、Motif 4和Motif 5这些保守的蛋白结构域（图2），表明烟草CBF基因家族在进化过程中较为保守。

图1 烟草CBF基因的系统发育进化树和基因结构Fig.1 Phylogenetic tree and gene structures of NtCBFs

图2 烟草CBF基因的蛋白结构域Fig.2 Protein domains of NtCBFs

对烟草CBF基因启动子序列进行顺式作用元件分析，发现烟草CBF基因上游启动子区存在生长发育、激素响应和胁迫响应等相关的顺式作用元件，其中光响应相关元件最多，其次为脱落酸响应、茉莉酸甲酯响应及厌氧诱导等相关元件。NtCBF3、NtCBF4、NtCBF5、NtCBF6、NtCBF10、NtCBF13、NtCBF14和NtCBF18等8个基因启动子序列分布有低温响应相关元件（图3）。

图3 烟草中CBF基因启动子顺式作用元件Fig.3 Cis-acting elements of CBF promoters in tobacco

2.2 两种育苗方式下的烟草CBF基因家族的低温应答分析

图4 冷处理后两种育苗方式的烟草CBF基因表达量分析Fig.4 Expression levels of NtCBFs under two seedling cultivation methods after cold treatment

分析低温处理前后两种育苗方式下烟草CBF基因家族表达量的变化（图4），发现相较常规漂浮育苗，水旱两段式育苗中NtCBF2、NtCBF3、NtCBF4、NtCBF5、NtCBF6、NtCBF9、NtCBF10、NtCBF11、NtCBF12、NtCBF13、NtCBF14、NtCBF20和NtCBF21基因的表达量显著提高，表明水旱两段式育苗中NtCBFs基因表达量更高；而低温处理后，相较常规漂浮育苗，水旱两段式育苗中NtCBF5、NtCBF12和NtCBF13基因的表达量显著提高，推测NtCBF5、NtCBF12和NtCBF13基因可能与水旱两段式育苗的抗低温胁迫能力的提高有关。

2.3 两种育苗方式下的烟草CBF-regulon基因的低温应答分析

对烟草CBF-regulon基因NtRD29A、NtRD29B和NtGOLS3在两种育苗方式下的低温应答进行分析（图5），发现相较常规漂浮育苗，水旱两段式育苗中NtGOLS3和NtRD29A基因的表达量显著升高；而低温处理后，相较常规漂浮育苗，水旱两段式育苗中NtGOLS3、NtRD29A和NtRD29B基因的表达量均显著升高。推测水旱两段式育苗可通过调控CBF-regulon基因NtGOLS3、NtRD29A和NtRD29B提高水旱两段式育苗的抗寒能力。

图5 冷处理后两种育苗方式的CBF-regulon相关基因表达量分析Fig.5 Expression levels of CBF-regulon related genes under two seedling cultivation methods after cold treatment

2.4 烟草非CBF-regulon相关基因的低温应答分析

对8个烟草非CBF-regulon基因在两种育苗方式下的低温应答进行分析（图6A），发现水旱两段式育苗的NtERD10C表达量比常规漂浮育苗显著降低，而其他7个基因均无显著差异。同时，对5个First wave基因在两种育苗方式下的低温应答进行分析（图6B），低温处理后，水旱两段式育苗的NtZAT12表达量比常规漂浮育苗显著降低，其他4个基因均无显著差异。综上，未发现有非CBF-regulon基因表达量在两段式育苗中高于常规漂浮育苗，推测水旱两段式育苗抗寒能力的提高可能不依赖于非CBFregulon途径。

图6 冷处理后两种育苗方式的非CBF-regulon相关基因表达量分析Fig.6 Expression levels of non-CBF-regulon related genes under two seedling cultivation methods after cold treatment

3 结论

系统分析21个烟草CBF基因进化关系、基因结构、蛋白质保守结构和启动子的顺式作用元件，发现烟草CBF基因进化上相对保守，可响应生长发育、激素响应和胁迫等多种信号，其中NtCBF3、NtCBF4、NtCBF5、NtCBF6、NtCBF10、NtCBF13、NtCBF14和NtCBF18等8个基因具有低温响应元件。低温胁迫下基因表达模式分析结果显示，烟草NtCBF5、NtCBF12和NtCBF13及CBF-regulon相 关基因NtRD29A、NtRD29B和NtGOLS3在低温处理后表达量显著升高，在烟草水旱两段式育苗的抗低温胁迫过程中发挥了重要作用。