HPLC 法测定保健食品中核苷酸的含量

刘艳荣

（山西健硕食品药品研究院有限公司，山西太原 030006）

核苷酸是构成核酸的成分，是由含氮的碱基、核糖或脱氧核糖、磷酸3种分子连接而成，在人体广泛分布，具有多种生物学功能。例如，母乳中就含有尿苷酸（Uridine Monophosphate，UMP）、胞苷酸（Cytidine Monophosphate，CMP）、 腺苷酸（Adenosine Monophosphate，AMP）、 鸟苷酸（Guanosine Monophosphate ，GMP）和肌苷酸（Cytidine Monophosphate，IMP）等多种核苷酸，为提高婴儿的免疫调节功能和记忆力发挥着重要作用。此外，鸟嘌呤核苷酸和次黄嘌呤核苷酸还有呈味和增鲜的作用，在味精、鸡精等调味品中广泛使用[1-2]。

目前，核苷酸类物质已作为一种功效成分被广泛添加于各种婴幼儿奶粉和保健食品中，通过改善细胞的活力而提高机体各系统的自身功能和自我调节能力，来达到最佳综合状态和生理平衡[3]。核苷酸花粉胶囊是一种以核苷酸和油菜花粉为主要原料制成的保健食品，经动物实验证明具有增强免疫力的保健功能[4]。

核苷酸含量的测定方法包括荧光比色法、毛细管电泳法、离子交换色谱法、液相色谱法和质谱法等，其中高效液相色谱法最为常用，而毛细管电泳法重现性较差，荧光比色法和离子交换色谱法存在较大的干扰，质谱法成本高，因此这几种方法使用较少。文献关于液相色谱法测定乳粉中核苷酸含量的报道较多[5]。由于核苷酸亲水性强，在普通C18柱上保留和分离效果欠佳，因此本研究优化建立了一套操作简单、结果稳定可靠的检测方法，为保健食品领域该类产品的质量检测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

高效液相色谱仪LC-20AT，岛津；超声清洗机SB-5200DTD，宁波新芝；电子天平AUW120D，岛津；ZORBAX SB-C18色谱柱；Acutfex PW-C18色谱柱；Shim-pack GIST C18色谱柱。

鸟嘌呤核苷酸（GMP），BePure，纯度98.3%；腺嘌呤核苷酸（AMP），Dr.E，纯度92.2%；次黄嘌呤核苷酸（IMP），PANPHY，纯度100.0%；胞嘧啶核苷酸（CMP），PANPHY，纯度99.2%；尿嘧啶核苷酸（UMP），BePure，纯度98.7%；甲醇和乙腈，Fisher 色谱纯；四丁基硫酸氢铵，美国MREDA；磷酸二氢钾，分析纯；氢氧化钾，分析纯；磷酸，优级纯；娃哈哈纯净水、芬格欣核苷酸绞股蓝口服液，市购。

1.2 色谱条件

色谱柱：Acutfex PW-C18；流动相：0.01 mol·L-1磷酸二氢钾∶甲醇=97 ∶3；流速：1 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：254 nm；进样量：10 μL。

1.3 标准溶液的配制

分别称取CMP、UMP、AMP、GMP 和IMP 标准品适量，精确到0.1 mg，用水溶解，配制成浓度分别为2 mg·mL-1的标准储备液；分别吸取一定体积的各标准储备液，用水稀释成不同浓度的混合标准工作液。

1.4 样品制备

精密量取供试品溶液1 mL 至100 mL 棕色容量瓶中，加入50 ℃左右的热水80 mL，超声30 min，冷却至室温后用水定容至刻度，过膜待上机测定。

1.5 含量计算

试样中各核苷酸含量测定的计算公式为

式中：X为试样中某种核苷酸的含量，mg·g-1或mg·mL-1；C为由标准曲线得出的试样溶液中某种核苷酸的浓度，μg·mL-1；V为试样定容体积，mL；n为样液稀释倍数；m为试样的质量或体积，g 或mL。

2 结果与分析

2.1 5种核苷酸液相色谱分离分析条件的确定

2.1.1 流动相的选择

核苷酸检测的液相色谱法主要是采用离子对试剂来延长化合物在反相色谱上的保留时间。本文参考国标GB 5413.40—2016 和文献[4-5]的方法配制了5种流动相进行比较，分别是A：0.2%磷酸 水∶乙 腈=97 ∶3；B：0.01 mol·L-1磷 酸 二 氢钾∶乙腈=97 ∶3；C：0.01 mol·L-1磷酸二氢钾∶甲醇=97 ∶3；D：（1.4 mmol·L-1四丁基硫酸氢氨+0.01 mol·L-1磷 酸 二 氢 钾）∶甲 醇=97 ∶3；E：（1.4 mmol·L-1四丁基硫酸氢氨+0.01 mol·L-1磷酸二氢钾）∶乙腈=97 ∶3，结果表明流动相C 和D 条件下5种核苷酸分离度都满足要求，峰形对称性较好，但是流动相D 离子对试剂和色谱柱固定相结合需要较长的平衡时间，且有机相比例的增减对离子对试剂影响很大，离子对试剂对柱子的伤害也大，而且与C 相比出峰时间较长，对基质复杂的乳制品可能更适合。核苷酸易溶于水，相比乙腈，甲醇的洗脱能力弱一些，出峰晚，容易和水溶性杂质分离，而且甲醇比例越低分离度越好，但是考虑到反相C18柱的耐水性和柱效问题，综合选择流动相C 进行检测。

2.1.2 流动相pH 的影响

核苷酸在酸性条件下比较稳定，本文将0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液用磷酸分别调节pH=3、pH=3.8、pH=4.8 进行实验，结果发现pH=3 时，只出了4个峰，经单个化合物标品确认，4个峰依次是CMP、UMP、GMP、AMP 和IMP，其 中GMP 和AMP 为第3个峰，完全重叠不能分离。pH=3.8 时，出峰顺序不变，其中AMP 和IMP 有交叉，分离度不够。pH=4.8 时，5种核苷酸均能有效分离，出峰顺序依次是CMP、UMP、GMP、IMP 和AMP，说明pH 变化对AMP 影响最大，pH 越低，出峰越早。最终选择流动相pH=4.8。

2.1.3 色谱柱的选择

本实验选择了SB-C18、PW-C18和Shim-pack GIST C18这3种色谱柱进行比较，5种核苷酸在这3种色谱柱上均可以有效分离。其中Shim-pack GIST C18峰形最好，PW-C18对化合物的保留时间稍长，分离度好，柱子本身耐水性较强，所以最终选择PWC18色谱柱进行方法验证。

2.2 方法学验证

2.2.1 标准曲线的测定

将核苷酸标准溶液稀释成不同浓度的标准系列，分别用不同浓度的标准溶液按上述色谱条件进样10 μL，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，通过回归计算求得回归方程和相关系数。结果如表1 所示，线性良好，可以用外标法进行定量测定。5种核苷酸的高效液相色谱图如图1 所示，分离度好，灵敏度高。

表1 5种核苷酸的标准曲线回归方程和相关系数

图1 5种核苷酸的高效液相色谱图（10 μg·mL-1）

2.2.2 方法重复性

分别量取6 份供试品溶液各1 mL，按照样品制备的方法在同一条件下进行含量测定，结果如表2所示。该样品中次黄嘌呤核苷酸（IMP）未检出，其余4种核苷酸含量的RSD 在0.26%～1.06%，满足方法验证的要求。

表2 供试品中5种核苷酸的含量结果

2.2.3 方法准确度

方法准确度采用标准添加测定回收率实验，以6 份样品测定的平均值为本底，平行精密量取9 份供试品各0.5 mL，按照低（1 mg）、中（2 mg）、高（3 mg）3个水平进行标准物质添加，含量测定同样品的测定，计算各水平的加标回收率，从而评价方法的准确度。结果如表3 所示，5种核苷酸加标回收率在96.2%～104.7%，说明该方法准确度好，结果可靠。

表3 供试品中5种核苷酸的回收率结果

3 结论

本文建立了保健食品中功效成分核苷酸含量的高效液相色谱测定方法，分别研究了流动相组成、流动相pH 对5种化合物的影响，同时比较了3种不同品牌的色谱柱的分离效果。结果表明流动相组成和pH 的影响最大，在5 ～100 μg·mL-1线性良好，相关系数大于0.999，平均回收率在96.2%～104.7%，样品重复性相对标准偏差为0.26%～1.06%。本方法操作简单，精密度好，准确度高，满足定量要求，为保健食品样品的核苷酸检测提供参考。