基于iTRAQ技术分析2种典型养殖模式下大口黑鲈肌肉蛋白组表达差异

周 聃， 王 曙， 周冬仁， 盛鹏程， 胡大雁， 周志金

(1.农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室/浙江省淡水水产研究所，浙江湖州 313001；2.浙江省湖州市农业科技发展中心，浙江湖州 313001)

大口黑鲈()，俗名加州鲈鱼，太阳鱼科、黑鲈属，肉质鲜美，肌间刺较少，深受广大消费者欢迎，具有广阔的市场前景。2019年，我国大口黑鲈养殖产量已达47.8万t，比2018年增长了10.6%。目前，大口黑鲈的主要养殖方式为专养和混养结合的传统池塘化养殖、网箱养殖和池塘内循环水养殖等模式。IPRA模式(又称“跑道”养殖)是集成循环流水养殖、生物净水、高效集污等技术于一体的新型养殖模式，该模式能够减少水体污染，改善鱼肉肉质，方便生产管理，在江苏、浙江、上海等地区被广泛推广。随着IPRA养殖技术的推广，大口黑鲈已成为我国主要的养殖淡水鱼品种，为渔业提质增效、农业乡村振兴提供重要支持。

iTRAQ技术是利用同位素标签标记蛋白基团，结合质谱分析，对不同样品中的蛋白质含量比较，确定差异蛋白，并分析其蛋白功能。该技术通量高、精度准、重复性好，已广泛应用于医学、食品科学和微生物学等领域。

对大口黑鲈品质研究主要涉及肌肉营养成分、质构等表观特征研究，对其更进一步的蛋白探索较为罕见。本研究采用iTRAQ技术对IPRA养殖和传统池塘养殖模式下的大口黑鲈进行定量蛋白质组学研究，分析2种养殖模式下鱼肉蛋白质组表达水平差异，并对其差异蛋白质生物信息学进行分析，获得IPRA养殖与传统池塘养殖模式下大口黑鲈蛋白质组表达水平的差异，从而为分析不同养殖模式下鲈鱼鱼肉品质和代谢差异靶标提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

同龄段IPRA养殖和传统池塘养殖大口黑鲈(450～500 g/尾)，购于湖州南浔某养殖场，同一饲料，养殖时间为2019年3—10月。每组取3尾鱼，0.5 h内运回实验室，采用自来水清洗，取其背部鱼肉，液氮速冻，-80 ℃贮存备用。

8-plex iTRAQ试剂盒，购自美国AB Sciex公司；PMSF，购自上海生工生物工程股份有限公司；丙酮，购自美国J.T.Baker公司；胎牛血清标准品BSA、TCEP、MMTS、三乙基碳酸氢铵缓冲液、氨水，购自美国Sigma公司；胰酶，购自美国Promega公司；乙腈、甲酸，购自美国Thermo公司。

1.2 仪器与设备

真空干燥仪冷冻离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)；超声仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；低温离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)；恒温箱(上海一恒科学仪器有限公司)；液相色谱LC-20AD(日本Shimadzu公司)；液相色谱Dionex Ultimate 3 000 RSLCnano、质谱仪Q Exactive(美国Thermo Scientific公司)。

1.3 试验与方法

1.3.1 蛋白质提取 称取约2 g鱼肉样品置于预冷研钵内，充分研磨至粉末状态，加入1 mL裂解液L3 SDS(使用前加1×PMSF)，超声(功率500 W，间隔1.5 s，时间1 s，超声5 min)，离心20 min(4 ℃，12 000 r/min)，收集上清液分装，每管250 μL，加入1 mL丙酮，-20 ℃过夜。离心20 min(4 ℃，12 000 r/min)，弃上清，干燥。采用Bradford法，对蛋白质进行定量。

1.3.2 蛋白FASP酶解及iTRAQ试剂标记 取200 μg蛋白溶液，加入蛋白质量比1/50的胰蛋白酶，37 ℃过夜；次日加入质量比1/100胰蛋白酶，37 ℃ 反应4 h，离心20 min(4 ℃，12 000 r/min)。加入50 μL 0.5 mol/L TEAB，离心20 min(4 ℃，12 000 r/min)，获得酶解液，利用iTRAQ试剂盒进行标记，具体见表1(传统池塘养殖标记为CT，IPRA养殖标记为PD)，下同。

表1 样本及标记物对照

1.3.3 液相分离及质谱鉴定 采用流动相A(HO，pH值=10)和流动相B(80% ACN，pH值=10)以0.2 mL/min流速进行梯度洗脱；洗脱条件为：0～5 min，5%B；5～10 min，5%～10%B；10～60 min，10%～40%B；60～65 min，40%～95%B；65～75 min，保持95%B；75～85 min，95%～5%B。在 214 nm 吸光度下监测洗脱过程，根据峰型和时间收取20个组分，每个组分取3 μg进行二维液相色谱分离。流动相分别为A(0.1%甲酸)，B(0.1%甲酸，80%ACN)，洗脱条件为：0～5 min，5%B；5～8 min，5%～10%B；8～40 min，10%～30%B；40～45 min，30%～35%B；45～50 min，35%～90%B；50～55 min，保持90%B；55～56 min，90%～5%B；56～65 min，保持5%B。每个组分分析时间为 65 min，流速为300 nL/min。

分离后的肽段进入质谱仪检测，一级质谱参数：分辨率为70 000，最大离子强度为3e6，最大注入时间为100 ms，扫描范围为350～1 800；二级质谱参数：分辨率为17 500，最大离子强度为5e4，最大注入时间为120 ms，母离子选择20个TopN，碰撞能量NCE为30。

1.3.4 蛋白鉴定和生物信息学分析 在Uniprot 数据库中，对肽段的质谱信息进行检索。将113、114、115混合作为池塘养殖组(CT)；116、118、119混合作为IPRA养殖组(PD)。将蛋白比率≥20或≤0.05除去。对其进行检验，<0.05，平均比率≥1.5或≤0.667为上调或下调差异蛋白，并进行GO、KEGG代谢通路和STRING网络通路分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白质鉴定

在大口黑鲈鱼肉中共鉴定出置信度在95%以上的蛋白质1 484个。2种养殖模式下大口黑鲈检测出差异蛋白152个，其中，上调蛋白98个，下调蛋白54个。蛋白表达丰度分布见图1。

2.2 GO功能分析

由图2可知，对152个差异蛋白进行GO 注释，其中，主要参与的分子功能有6个，包括：结合(85个)、催化活性(64个)、结构分子活性(14个)、转运活性(8个)、分子功能调节剂(8个)、分子载体活性(3个)；细胞位置2个，包括细胞解剖实体(84个)、蛋白质复合体(37个)；生物过程14个，其中蛋白数量较高的主要是细胞过程(58个)、代谢过程(49个)、细胞定位(14个)、生物调节(10个)。

2.3 差异蛋白通路分析

KEGG代谢通路分析结果见表2。由表2可知，差异蛋白一共参与142个信号转导通路。其中，主要的代谢通路包括次生代谢产物的生物合成(26个)、肌动蛋白细胞骨架调节(16个)、碳代谢(16个)、蛋白质消化吸收(13个)、氨基酸的生物合成(12个)、糖酵解(11个)、氧化磷酸化(6个)、柠檬酸循环(6个)、嘌呤代谢(5个)、钙信号通路(5个)。

表2 两种养殖模式下大口黑鲈差异蛋白途径富集分析

2.4 目标差异蛋白确定

根据上述差异蛋白分析情况及相关文献资料，由表3可知，筛选得鱼肉品质密切相关的28个目标差异蛋白，主要分成6类，分别为肌动蛋白细胞骨架调节8个(上调5个，下调3个)、糖酵解8个(均上调)、柠檬酸循环5个(均上调)、氧化磷酸化3个(均上调)、钙信号通路3个(上调2个，下调1个)和热休克1个(上调)。

表3 两种养殖模式下大口黑鲈目标差异蛋白

2.5 目标差异蛋白STRING网络通路分析

STRING网络数据库信息全面、操作简便，广泛运用于蛋白质网络结构分析。由图3可知，在28个目标蛋白质中，有24个蛋白存在相互作用，共162个相互关系，形成了一个多中心互作网络。各蛋白间通过多条通路进行调节，中心蛋白除与周边蛋白间存在相互关系外，与其他中心蛋白间也存在着相互关系。

3 讨论与结论

鱼肉是优质蛋白质来源，营养价值丰富。蛋白质在生命活动中起着重要作用，其结构和含量变化影响各类生理生化反应，如细胞凋亡、糖酵解反应、信号转导等，从而对鱼肉品质产生相应的影响。因此，通过研究不同养殖模式下大口黑鲈鱼肉蛋白质差异对提高鱼肉品质及调控具有深远意义。

结果显示，IPRA养殖的大口黑鲈与传统池塘养殖的大口黑鲈相比，共有差异蛋白152个，其中，上调98个，下调54个；根据条件，筛选得鱼肉品质密切相关的目标差异蛋白28个，主要分为6类，分别为肌动蛋白细胞骨架调节、糖酵解、柠檬酸循环、氧化磷酸化、钙信号通路和热休克蛋白。其中，与肌动蛋白细胞骨架调节有关的目标差异蛋白共有8个，分别为6个肌球蛋白重链(MHC)、1个根蛋白(Radixin)和1个肌球蛋白轻链-2(MYL2)；与糖酵解有关的目标差异蛋白有8个，分别为葡萄糖-6-磷酸异构酶、ATP依赖性6-磷酸果糖激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(2个)、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、2-磷酸--甘油酸氢裂解酶和-乳酸脱氢酶；与柠檬酸循环(TCA循环)有关的目标差异蛋白有5个，分别为丙酮酸脱氢酶复合物乙酰基转移酶组分、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶和乌头酸水合酶(2个)；与氧化磷酸化的目标差异蛋白有3个，均与细胞色素c氧化酶有关；与钙信号通路有关的目标差异蛋白有3个，分别为钙调素结合蛋白、肌钙蛋白C(TnC)和钙转运ATP酶蛋白；与热休克(HSP)有关的目标差异蛋白有1个，为HSP60。

鱼肉肌纤维分慢收缩型、快收缩型和中间型3类。慢收缩型纤维属有氧代谢型肌纤维，含有丰富的线粒体、细胞色素和肌球蛋白、显红色，主要与慢速游泳有关。快收缩型纤维属酵解代谢型肌纤维，细胞色素或肌球蛋白含量较少、显白色，主要与快速突然游泳有关。中间型纤维位于两者之间，呈粉红色，属于过渡类型。

MHC是指沿着肌肉纤维排列的细丝，通过收缩、保持和控制释放控制肌肉运动，是负责运动的主要蛋白。2种养殖模式下MHC差异均为快收缩型纤维差异，这主要与流水运动下糖酵解代谢差异有关。由于处于流水运动下，细胞形态变化复杂，快收缩性MHC蛋白发生复杂变化(3个上调，3个下调)。根蛋白能够连接肌动蛋白，影响细胞生长、迁移、分裂及信号转导等功能。MYL2为调节性轻链，能够影响肌球蛋白重链上ATP 酶的活性，使肌纤维的类型出现转变，影响肌肉生长。IPRA养殖与传统池塘养殖相比，其鱼肉根蛋白和MYL2表达均明显上调，这可能导致IPRA养殖的鱼体肌肉在肌纤维排布上更加致密，纤维直径更加粗壮，从而使肉质品质高于池塘养殖的鱼体。

IPRA养殖与传统池塘养殖相比，鱼肉中与糖酵解有关的8个差异蛋白表达均明显上调，表明其具有更强的糖酵解能力。在牛、羊肉中有研究表明，糖酵解能力与其肉质品质呈反比。哺乳动物肌肉纤维数在幼期就已固定，然而鱼类生长过程中持续有快速收缩型纤维补充。此外，Sun等还研究发现，葡萄糖-6-磷酸异构酶具有通过抑制丝氨酸蛋白酶(MBSP)活性来防止肌原纤维分解的功能。IPRA养殖的大口黑鲈具有较强的糖酵解能力，这可能与其长期处于流水运动状态有关。在柠檬酸循环中，糖类、脂肪、蛋白质会分解产生能量贮存在ATP中，从而供给生物体。柠檬酸循环过程中发生的反应会影响肉质的嫩度及脂肪含量。IPRA养殖的大口黑鲈与传统池塘养殖相比，与柠檬酸循环有关的5个差异蛋白表达均明显上调，表明其具有更强的柠檬酸循环能力，同样可能与其长期处于流水运动状态有关。

细胞色素c氧化酶是终端氧化酶，多存在于线粒体中，含有血红素，影响肌肉颜色。IPRA养殖的大口黑鲈与传统池塘养殖相比，与氧化磷酸化有关的3个细胞色素C氧化酶差异蛋白表达均明显上调，这可能是由于长期处于流水运动，需要更高的代谢，从而使肌纤维中的与色泽有关的肌纤维发生改变。

钙调素结合蛋白是通过抑制肌浆中Ca释放来介导Ca信号传递，从而调节细胞生理功能。TnC是与钙结合的靶分子，能够调控骨骼肌收缩。TnC通过与Ca结合，产生应激反应，促进蛋白合成和肌肉增长。钙转运ATP酶是影响钙离子转运的重要蛋白，其活性越高，越容易释放Ca。Ca的释放会使肌肉不可逆收缩，导致肉的含水性和嫩度下降。在3个目标差异钙信号通路调节蛋白中，IPRA养殖的大口黑鲈与传统池塘养殖相比，钙调素结合蛋白和TnC表达均上调，而钙转运ATP酶表达下调，表明IPRA养殖的大口黑鲈鱼肉Ca结合能力较强，释放较少。

HSP蛋白是机体在应激条件下迅速合成的一类蛋白，其保守性和应激性较高，可作为分子伴侣与不同的多肽链非特异性结合，催化介导蛋白质特定构象的形成。HSP60是分子量约为60 ku的一个HSP蛋白，能够促进脂肪分解，与肉的嫩度密切关联。IPRA养殖的大口黑鲈与传统池塘养殖相比，其HSP60表达明显上调，反映了IPRA养殖的鲈鱼其耐热应激性要好于传统池塘养殖。

综上所述，与传统池塘相比，IPRA养殖的大口黑鲈肌肉中糖酵解、TCA循环、氧化磷酸化、钙离子结合以及抗应激能力均显著加强，表明IPRA养殖通过加强一定的运动，提高了鱼体代谢，从而改善了鱼肉营养和品质。