黄瓜枯萎病拮抗放线菌的筛选及防治效果

李培谦， 药 震， 邵元元， 冯宝珍

[1.北部湾环境演变与资源利用教育部重点实验室/广西地表过程与智能模拟重点实验室(南宁师范大学)，广西南宁 530000；2.运城学院生命科学系，山西运城 044000]

黄瓜真菌性枯萎病(Fusarium wilt disease)是黄瓜生产上的毁灭性病害之一，该病害由尖孢镰刀菌黄瓜专化型(f. sp.)引起，该病害在世界黄瓜种植区广泛发生，给黄瓜生产造成严重损失。该病的化学防治常以多菌灵、咪鲜胺、恶霉灵、代森锰锌等杀菌剂为主，但高频次、大剂量使用化学药剂给生态环境带来巨大压力，农药残留和环境安全已经成了危害人类健康的棘手问题。因而，从环保生态角度研究广谱高效的生防菌对枯萎病防治具有不可替代的作用。

近年来报道的对黄瓜枯萎病具有拮抗作用的微生物有真菌、细菌和放线菌。棘孢木霉()、哈茨木霉()和拟康氏木霉()联合接种对黄瓜枯萎病防效可达81.5%，而深绿木霉()的水分散粒剂效果优于哈茨木霉。葡萄汁有孢汉逊酵母()菌株 1-101 在固体培养基上对黄瓜枯萎病病菌具有完全抑制作用。芽孢杆菌中巨大芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌等均对黄瓜枯萎病菌具有抑制作用。而放线菌中对黄瓜枯萎病具有良好抑制效果的生防菌以链霉菌属()居多，如黄赭色链霉菌()11F菌株对黄瓜枯萎病防效为73.45%，比基尼链霉菌() HD-087菌株对黄瓜枯萎病菌具有明显的抑制效果；对黄瓜枯萎病菌抑制率达到53.3%；龟裂链霉菌() M527菌株发酵产物黄瓜枯萎病菌的拮抗作用明显。然而，放线菌资源丰富，种类繁多，已研究报道的种类有限。而且，由于目前使用的一些化合物的高残留性以及病原物出现的抗药性，所以挖掘新抗生素和其他生物活性代谢物仍然是新药研究的重要目标。

本研究以农业生产上难以防治的黄瓜枯萎病菌为靶标，进行拮抗放线菌筛选，并对高活性菌株进行发酵复筛、种类鉴定、室内及离体防效研究。本研究旨在为黄瓜枯萎病生物防治提供理论依据，也为拮抗生防菌资源开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2018年10月至2020年11月在运城学院逸夫实验楼及智能温室开展。2018年10月于山西省运城市北相镇黄瓜大棚采集土壤样品，采用五点取样法在健康黄瓜根际取土。取50～100 g土样装入无菌自封袋备用。供试病原菌黄瓜枯萎病菌(f. sp.)保存于笔者所在实验室。

高氏一号培养基：1 g KNO、0.5 g KHPO、0.5 g MgSO、0.5 g NaCl、0.01 g FeSO、20 g可溶性淀粉，1 000 mL蒸馏水。马铃薯葡萄糖(PDA)培养基：200 g马铃薯，15 g 葡萄糖，1.5%琼脂粉，1 000 mL 蒸馏水。10%小米培养基：10 g葡萄糖，3 g蛋白胨，2.5 g NaCl，2 g CaCO，10 g小麦，1 000 mL 蒸馏水，pH值=7.2。

1.2 放线菌的分离与纯化

将风干土样研磨成粉，称取10 g倒入90 mL无菌水中，搅拌溶解后静置10 min，取上清液。将上清液梯度稀释后与50 ℃左右高氏一号培养基混匀后倒平板，置于28 ℃培养箱培养1周，长出菌落后转接到新的高氏一号平板，具体方法参见文献[15]。

1.3 拮抗放线菌的筛选

1.3.1 拮抗菌株的初筛 根据参见文献[16]的方法，准备放线菌和黄瓜枯萎病菌菌饼。将黄瓜枯萎病菌菌饼接种于PDA平板中央，同时将放线菌菌饼接种于距病原菌约2.0 cm的四周，25 ℃培养7 d，对照组只接黄瓜枯萎病菌菌饼。观察病原菌菌落生长情况，并测量菌落直径，每个处理重复3次。

1.3.2 放线菌发酵液活性测定 放线菌CA-6用高氏一号液体培养基于28 ℃、180 r/min振荡培养72 h；然后再按6%的接种量接入到装液量为 200 mL 的10%小米培养基中(500 mL三角瓶)，在上述培养条件下发酵5 d。发酵结束后，用快速定性滤纸抽滤得到发酵液；所得发酵液再用0.22 μm的无菌滤器过滤，置于4 ℃冰箱备用。

采用滤纸条法和牛津杯法检测发酵液的抑菌活性。滤纸条法：PDA平板正中接病原菌菌饼，然后在菌饼两侧同等距离处贴滤纸条，然后加入 100 μL 发酵液浸润，以无菌水作为对照，试验重复3次。牛津杯法：制备1.0×10个/mL黄瓜枯萎病分生孢子悬浮液，将200 μL 孢子悬浮液均匀涂布在PDA平板上，然后将4个无菌牛津杯均匀放置在PDA平板上，将200 μL发酵滤液置于牛津杯中，以无菌水为对照，将平板置于25 ℃下恒温培养5 d，然后测量抑菌圈宽度，每个处理设置3个重复。

1.4 拮抗菌株的分类地位

1.4.1 表型特征及生理生化特征 在高氏一号培养基上培养7～10 d，观察气生菌丝、基内菌丝颜色，可溶性色素的有无，根据文献描述的方法对菌株进行初步鉴定。采用插片法观察菌株CA-6在高氏一号培养基的基内菌丝形态和孢子特征。菌株生理生化特性分析参照《放线菌快速鉴定与系统分类》和《微生物资源学》中相应章节的描述进行。

1.4.2 分子鉴定 利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取CA-6基因组DNA，以细菌16S rDNA通用引物27F：5′-A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G-3′ 和1492R：5′-G G C T A C C T T G T T A C G A C T T-3′进行PCR扩增。50 μL反应体系：2×Master Mix 25 μL、基因组DNA 1 μL、引物各1 μL，ddHO补足至50 μL。反应程序为 94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32个循环；最后72 ℃ 10 min。

扩增产物经电泳初步检测后，送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI中进行BLAST 分析比对，并下载模式菌株的16S rDNA 序列。 采用MEGA-X构建NJ(Neighbour-Joining)系统发育树以明确菌株分类地位。

1.5 CA-6对黄瓜枯萎病的拮抗活性及防效测定

1.5.1 发酵液对黄瓜枯萎病菌丝生长的影响 25 ℃ 培养箱内将黄瓜枯萎病病菌在PDA平板上培养1周，用打孔器取菌饼(直径7 mm)。将无菌发酵原液与PDA 培养基按一定比例混匀制成含药平板，使发酵液稀释成5、10、50、100、200 倍液；将菌饼接至平板中央，25 ℃下培养7 d 后，以十字交叉法测量菌落直径大小，计算菌丝生长抑制率。菌丝生长速率计算公式参照文献[16]进行。以无菌水的处理为对照，设置3个重复。

1.5.2 发酵液对黄瓜枯萎病病菌分生孢子萌发的影响 制备浓度为1.0×10个/mL的黄瓜枯萎病孢子悬浮液；加入适量上述发酵液将孢子悬浮液终浓度调为1.0×10个/mL，于25 ℃暗培养24 h后镜检，每个处理观察3个视野，分别观察50 个分生孢子，统计孢子萌发率。如果分生孢子抽出芽管(芽管长度至少为分生孢子长度的一半)、长出菌丝，则判定分生孢子已萌发。以无菌水为对照，每个处理3个重复，参照文献中方法计算孢子萌发率。

1.5.3 CA-6发酵液对盆栽黄瓜苗的防治效果 利用盆栽黄瓜苗测定CA-6对黄瓜苗期枯萎病的室内防效。按上述方法制备黄瓜枯萎病病菌孢子悬浮液10个/mL，接种感病黄瓜品种(9930)的幼苗。试验设置2个处理：(1)接种病原菌+CA-6发酵液原液；(2)接种病原菌分生孢子悬浮液，每个处理使病原菌分生孢子终浓度调节为10CFU/mL，分别移栽20棵黄瓜幼苗并用50 mL接种液灌根处理。具体测试方法参见文献[23]。试验设置3个重复，14 d后测量并记录发病情况，计算病情指数和防治效果。病情指数=Σ(病株数×相应级数)/总株数×最高级数×100；防治效果=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100%。

1.6 数据处理

采用SPSS 20.0 统计分析软件对测量数据进行差异显著性检验(Duncan’s新复极差法，=0.05) 。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株分离

共获得48株放线菌纯培养，编号为CA-1～CA-48。通过形态观察，初步去除重复菌株，根据平板对峙培养结果，发现对黄瓜枯萎病具有明显拮抗作用的放线菌有5株(表1)，其中菌株CA-6抑菌率达69.36%，因此本研究选择CA-6进行后续试验(图1)。

表1 放线菌对黄瓜枯萎病菌的抑制作用初筛结果

2.2 拮抗放线菌复筛

对拮抗放线菌进行复筛，结果表明，发酵液抑菌活性显著，牛津杯周围出现了明显的抑菌圈，抑菌圈直径可达17.8 mm(图2-A)；浸润发酵液的无菌滤纸条具有明显的抑制活性，而对照组病原菌能正常生长(图2-B、图2-C)。因此，放线菌CA-6发酵液具有明显的抑菌活性，可以作为黄瓜枯萎病候选生防菌用于后续试验。

2.3 CA-6菌株鉴定

2.3.1 形态特征 放线菌CA-6在高氏一号培养基上菌落呈扁平状，近圆形，孢子丝乳白色，培养过程中无色素产生(图3)；其基丝连续、气生菌丝发达，可产生大量孢子。

2.3.2 生理生化特征 根据《放线菌快速鉴定与系统分类》和《微生物资源学》的相关章节方法对菌株生理生化进行分析。由表2可知，菌株 CA-6 能使淀粉、纤维素水解，能使牛奶凝固和胨化，能使明胶液化，不能使硝酸盐还原，不能产生硫化氢。能利用-葡萄糖、-果糖、蔗糖，不能利用麦芽糖、鼠李糖。

表2 菌株CA-6 的生理生化特征

2.3.3 分子鉴定 对放线菌株CA-6进行分子鉴定，结果表明，放线菌株CA-6的16S rDNA核苷酸总长为1 433 bp(GenBank登录号：MW652689)。经BLAST比对分析，发现与菌株 CA-6 同源性高者均属于链霉菌属。下载16个典型菌株的16S rDNA 序列用MEGA-X 软件Neighbor-Joining法构建进化树。图4结果表明，菌株CA-6与(FN646641.1)亲缘关系最近，聚为一支，因此将菌株CA-6 初步鉴定为卡那链霉菌()。

2.4 放线菌CA-6对黄瓜枯萎病的抑菌活性及盆栽防效

2.4.1 发酵滤液对黄瓜枯萎病分生孢子萌发的抑制作用 经不同浓度发酵滤液处理的黄瓜枯萎病分生孢子萌发率差异明显，说明CA-6 发酵滤液对黄瓜枯萎病菌分生孢子萌发具有明显的抑制效果。稀释5倍的发酵液处理的黄瓜枯萎病菌孢子萌发抑制率达100.00%。当发酵液稀释10倍时对分生孢子的抑制率为87.50%，稀释100倍时，对病原菌分生孢子萌发抑制率仍达54.80%，而当稀释到200倍时，抑制效果明显减弱，分生孢子萌发抑制率只有13.71%，抑菌活性显著降低(表3)。

表3 菌株CA-6发酵滤液对黄瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制作用

2.4.2 发酵液对黄瓜枯萎病菌生长的抑制效果 由表3可知，CA-6发酵液对黄瓜枯萎病菌菌丝生长抑制效果明显。当发酵液稀释5倍时，对病原菌菌丝生长抑制率为96.22%；当稀释10倍时，抑制率为87.61%；当稀释100倍时，菌丝抑制率下降到50.30%。当稀释200倍时，菌丝抑制率为10.40%，抑菌活性显著降低。

2.4.3 发酵液对黄瓜枯萎病的防效 将CA-6菌株发酵后进行黄瓜枯萎病盆栽防效测定，结果(表4)表明，接种菌株CA-6发酵原液有效降低了黄瓜枯萎病的发病，发病率明显降低，防治效果达67.37%。CA-6发酵液拮抗黄瓜幼苗枯萎病效果明显，具有生防菌株的潜力，具有良好的应用前景。

表4 菌株CA-6发酵滤液对盆栽黄瓜苗防病效果

3 讨论与结论

真菌性枯萎病是农业生产上重要的土传病害，主要由镰孢菌属真菌尖孢镰孢菌(Schl.) 引起。据报道大田作物、园林花卉、林果及保护地蔬菜等均能发生真菌枯萎病，造成严重损失。枯萎病病原菌生存能力强、 传播途径多，一旦发病很难根治。因此，近年来利用高活性生防菌防治枯萎病是治理该类病害的重要途径。筛选高防效拮抗微生物菌株是生防制剂开发的重要基础，本研究从黄瓜根际土壤中分离到一株对黄瓜枯萎病菌具有强烈拮抗作用的菌株CA-6，该菌株对黄瓜枯萎病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用明显。目前国内外枯萎病拮抗放线菌以链霉菌属生防菌报道居多，HD-087对黄瓜枯萎病菌具有明显的抑制效果；菌株S-101()能抑制黄瓜枯萎病菌，而且对尖镰孢菌黏团专化型(f. sp.)有抑制作用；对苦瓜枯萎病具有良好的抑制作用；sp.CB-75 对香蕉枯萎病有较好的抑制作用；这些研究均表明链霉菌具有控制土传病害的巨大潜力。据报道，卡那链霉菌对苜蓿炭疽病菌及粉红镰孢、尖镰孢等苜蓿根腐病菌均表现出良好的拮抗效果；本研究将菌株CA-6初步鉴定为卡那链霉菌，该研究首次报道了用于枯萎病防治的卡那链霉菌。

链霉菌应用于生物防治主要是利用活体竞争作用，诱导或提高植物抗病性和代谢产物抑菌作用。本研究中滤纸条和牛津杯试验结果均能证明CA-6发酵液对黄瓜枯萎病菌拮抗效果显著。本研究中共同接种黄瓜枯萎病菌与放线菌时比单一接种病原菌组的黄瓜苗发病率降低了42.09百分点，温室条件下，CA-6发酵液对黄瓜苗期枯萎病的防效达到67.38%，表明放线菌CA-6对病原菌的生防作用是由于发酵活性物质。据报道，放线菌菌株 S-101发酵液对黄瓜枯萎病防效达57.11%，杀结节链霉菌()的代谢产物对稻瘟病的抑菌作用，都与本研究结果相似；而链霉菌菌株0250菌悬液对盆栽和大田苦瓜枯萎病菌的防效和促生作用明显，说明放线菌具有抑菌促生作用。而影响放线菌抗菌活性物质产生的关键因素是发酵条件，因此优化发酵条件是提高活性成分含量的必经途径。本试验通过小米培养基发酵，后续研究将通过单因素和正交试验优化发酵条件，以确定最佳发酵条件，提高活性成分含量。再者，生防菌能否在植物根部定殖也是决定大田试验效果的重要因素，本研究下一步将通过荧光蛋白标记技术确定其定殖特性。本研究未确定该放线菌的抑菌活性物质，后续将通过层析技术、色谱技术等确定活性物质的成分及结构。