亚致死浓度吡虫啉和毒死蜱对柑橘木虱成虫组织蛋白酶基因表达的影响

舒本水，邹 燕，张婉莹，冯 杰，吴仲真，林进添

(仲恺农业工程学院/广州市亚热带果树重大疫情控制重点实验室，广州 510225)

柑橘木虱DiaphorinacitriKuwayama属于半翅目Hemiptera木虱科Psyllidae昆虫，是一种全球性的重要柑橘害虫。其为害柑橘的方式多种多样，其中最主要的为害方式是作为韧皮部杆菌属类细菌-柑橘黄龙病菌Candidatusliberibacterspp.的传播媒介，引起柑橘黄龙病(Huanglongbing)在柑橘植株间的传播与流行，对柑橘产业造成巨大的经济损失(Bové,2006)。柑橘木虱高龄若虫及成虫取食带毒植株韧皮部汁液后均能获取黄龙病菌，且病原菌能够在柑橘木虱体内进行繁殖(Arpetal.,2016;江宏燕等,2018)。成虫带毒后转株为害时将黄龙病菌通过口针注入健康植株韧皮部，导致病菌在植株间传播(陈梦瑶等,2019;王飞凤等,2020)。黄龙病菌侵染植物后初期树冠新梢叶片出现黄化、班驳等症状，随后植物生长势衰退，水果品质下降，产量锐减，寿命缩短，最终整株死亡(Kishketal.,2017;乌天宇等,2020)。此外，柑橘木虱还能通过直接取食植物韧皮部汁液造成植物营养丢失；排泄蜜露于植物叶片诱发霉菌生长及阻碍植物光合作用等方式影响柑橘的正常生长发育(舒本水等,2020)。由于尚未发现针对柑橘黄龙病菌特效药，因此通过控制柑橘木虱种群数量以减缓黄龙病的传播是当前全球范围内防治柑橘黄龙病最主要的方法之一(Grafton-Cardwelletal.,2013)。而目前控制柑橘木虱数量发生最为直接有效的方法是化学防治。生产上最常用的化学杀虫剂包括有机磷类、新烟碱类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、阿维菌素类及一些生物源农药(田发军等,2018)。在杀虫剂的施用过程中，除直接杀死靶标害虫外，由于害虫个体接触药剂剂量的差异、时间推移及环境因素引起的农药降解导致部分存活个体表现出亚致死效应，其在生长发育、繁殖以及抗药性等方面均会发生显著变化(宋亮等,2003;李志雄等,2020)。在农药亚致死浓度胁迫下，害虫常通过调控自身的生理生化反应等策略进行响应(张莉娅等,2021)。

组织蛋白酶(Cathespins)是一类存在于溶酶体中的胞内蛋白酶，最初以酶原的形式在核糖体合成，随后被铁转运蛋白转移至内质网和高尔基体并通过糖基化和磷酸化形成甘露糖-6-磷酸蛋白，然后被溶酶体上的甘露糖-6-磷酸特异性受体识别，转运至溶酶体中，在酸性环境下水解成为具有活性的成熟组织蛋白酶(潘光照,2018)。根据活性中心氨基酸残基可将组织蛋白酶分为3大类：半胱氨酸蛋白酶(包括组织蛋白酶B、F、H、L、K、O、S、T、V、X和W)，天冬氨酸蛋白酶(组织蛋白酶D和E)以及丝氨酸蛋白酶(组织蛋白酶A和G)(Sunetal.,2018)。目前在多种昆虫中已鉴定出不同种类的组织蛋白酶，进一步功能分析发现组织蛋白酶属于多功能蛋白酶系，在昆虫蛋白降解、生长发育及响应不利刺激等多个生理过程中具有重要作用(Saikhedkaretal.,2015)。例如：黑腹果蝇Drosophilamelanogaster组织蛋白酶B在胚胎发育过程中参与卵黄蛋白的降解；而组织蛋白酶L可能参与食物蛋白消化(Medinaetal.,1988;Matsumotoetal.,1995)。棉铃虫Helicoverpaarmigera组织蛋白酶HaCat L被证实通过裂解激活Ha-caspase-1促进中肠细胞凋亡，进而参与棉铃虫变态发育过程幼虫中肠降解以及蛹和成虫中肠重建(Yangetal.,2017)。家蚕Bombyxmori化蛹过程中蜕皮激素20E上调组织蛋白酶BmCatB，BmCatD，BmCatL1和BmCatL2的表达，加速脂肪体的破坏(Guoetal.,2018)。家蚕和柞蚕Antheraeapernyi组织蛋白酶O参与对大肠杆菌Escherichiacoli的应激反应，推测其在两种昆虫的先天免疫系统中具有重要作用(Zhangetal.,2015;Sunetal.,2017)。

目前柑橘木虱中已鉴定出多种组织蛋白酶，如DcCath-B，DcCath-L，DcCath-L1和DcCath-O等。时空表达分析结果表明DcCathB在若虫、成虫期及肠道组织中高表达，推测其可能具有消化功能(Ferraraetal.,2015)。而DcCath-L和DcCath-O同样被证实在中肠组织中高表达。采用热杀死的两种细菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus)及黄龙病菌CLas侵染木虱后DcCath-L和DcCath-O基因表达量显著上调，推测两种组织蛋白酶可能参与柑橘木虱免疫反应(Yuetal.,2019)。DcCath-L1在卵中的表达量高于若虫和成虫，推测其可能参与胚胎发育。进一步研究发现4种重组的柑橘半胱氨酸蛋白酶抑制剂中CsinCPI-2对DcCath-L1活性抑制效果最强(Ferraraetal.,2020)。吡虫啉和毒死蜱是柑橘园中应用较广的杀虫剂，目前尚未报道吡虫啉和毒死蜱对柑橘木虱组织蛋白酶的影响相关研究。为明确农药亚致死浓度对柑橘木虱组织蛋白酶基因的影响，本研究选用吡虫啉和毒死蜱作为供试药剂，通过生物活性测定方法得到两种药剂的亚致死浓度，结合转录组和NCBI数据库鉴定得到柑橘木虱组织蛋白酶家族基因，荧光定量PCR比较分析两种药剂亚致死浓度对柑橘木虱多种组织蛋白酶基因转录水平表达量的影响，为进一步探究昆虫组织蛋白酶基因功能提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试柑橘木虱成虫

本实验使用的柑橘木虱成虫为实验室饲养种群，以九里香Murrayaexotica植株为其寄主植物进行长期饲养并未接触化学药剂，饲养条件：温度25±1℃，相对湿度65%±5%，光周期12 h ∶12 h。

1.2 供试试剂及主要仪器

吡虫啉原药来源于佛山盈辉作物科学有限公司；毒死蜱原药(97%)来源于浙江东风化工有限公司；RNAiso plus购于TaKaRa公司；逆转录试剂盒FastKing RT Kit(With gDNase)购于天根生化科技(北京)有限公司；荧光定量PCR SuperMix购于TransGen Biotech公司；人工气候箱购于上海莫托斯科学仪器有限公司，荧光定量PCR仪购于Roche公司。

1.3 室内毒力测定

将两种原药采用丙酮进行溶解，用含有0.05% Triton X-100的无菌水分别稀释为6个浓度梯度(25，50，100，150，200和250 mg/L)。取新鲜的九里香枝条洗净后侵入药液中10 s后取出，室温晾干1 h。将晾干的九里香枝条固定于9 cm培养皿中，采用吸水的棉花保湿并置于直径约10 cm，高7.3 cm的圆形塑料盒中。然后再每盒接入50头柑橘木虱成虫，每个浓度进行3次重复。24 h后体视镜下检查成虫死亡情况，毛笔轻触虫体无活动则视为死亡。采用Probit软件进行毒力曲线构建并计算LC20和LC50值。

1.4 亚致死浓度处理柑橘木虱成虫

具体处理方法同步骤1.3。采用吡虫啉和毒死蜱LC20和LC50浓度处理柑橘木虱成虫24 h，以含有0.05% Triton X-100的无菌水处理的九里香枝条饲喂的柑橘木虱成虫作为对照。处理24 h后收集存活的成虫至新的离心管中，液氮速冻后置于-80℃保存备用。

1.5 柑橘木虱组织蛋白酶基因鉴定及序列分析

通过NCBI数据库进行柑橘木虱组织蛋白酶基因搜索，同时对柑橘木虱转录组数据进行Blast比对，鉴定出柑橘木虱组织蛋白酶基因。采用DNAMAN软件对鉴定得到的柑橘木虱组织蛋白酶基因蛋白序列进行比对分析。

1.6 RNA提取及cDNA合成

将1.4中收集的成虫采用组织研磨器进行研磨后加入RNAiso plus试剂进行裂解，然后根据RNA提取说明书进行柑橘木虱成虫总RNA提取。采用Nano-100超微量分光光度计(ALLSHENG公司)测定各个样品总RNA纯度和浓度。选取等量的总RNA，采用FastKing RT Kit(With gDNase)进行反转录。在PCR管中配制基因组DNA去除体系混合液：5×gDNA Buffer 2.0 μL，总RNA 2.0 μg，加RNase-Free ddH2O补足10.0 μL。42℃孵育2 min后冰上放置。然后配制反转录反应体系混合液：10×King RT Buffer 2.0 μL，FastKing RT Enzyme 1.0 μL，Mix FQ-RT Primer Mix 2.0 μL，加RNase-Free ddH2O补足10.0 μL。混匀后将反转录反应体系混合液加入基因组DNA去除体系混合液中混匀，置于PCR仪中42℃，15 min，95℃，3 min孵育。合成的cDNA置于-20℃保存。

1.7 荧光定量PCR

根据所得的8个柑橘木虱组织蛋白酶核苷酸序列设计荧光定量PCR引物并送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行合成。具体引物序列详见表1。以上述合成的cDNA稀释5倍作为模板进行荧光定量PCR反应。于384微孔PCR板上配置10.0 μL反应体系：TransStart Tip Green qPCR SuperMix 5.0 μL，cDNA 1.0 μL，基因上下游引物各0.5 μL，加ddH2O补足10.0 μL，混匀并简短离心后置于荧光定量PCR仪进行反应。每个cDNA模板设置 3个技术重复。反应条件为：95℃变性3 min；95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s循环45次；最后熔解曲线范围为65℃～95℃。选取柑橘木虱EF1α(XM_008479903.1)和RPL13(DQ675552.1)作为内参基因对荧光定量PCR结果进行校正，采用2-ΔΔCt法分析两种化学药剂亚致死浓度胁迫下柑橘木虱成虫8种组织蛋白酶转录水平变化。

表1 本研究所用的引物序列信息Table 1 Sequence information of primers used in this study

1.8 数据分析

试验数据以“平均值±标准误(SE)”表示。采用SPSS 17.0软件对组织蛋白酶表达量数据进行单因素方差分析，多重检验法(DMRT法)进行差异显著性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 吡虫啉和毒死蜱对柑橘木虱成虫的亚致死浓度测定

室内毒力测试结果表明，吡虫啉对柑橘木虱成虫24 h的LC20和LC50值分别为14.19 mg/L和97.88 mg/L；毒死蜱对柑橘木虱成虫的LC20和LC50值分别为3.73 mg/L和47.94 mg/L(表2)。

表2 吡虫啉和毒死蜱对柑橘木虱成虫的室内毒力测定结果Table 2 Toxicity of imidacloprid and chlorpyrifos against Diaphorina citri adults

2.2 柑橘木虱组织蛋白酶氨基酸序列比对及发育进化分析

通过Blast比对，本研究于柑橘木虱成虫转录组及NCBI数据库中得到8个组织蛋白酶基因，分别为DcCath-B，DcCath-F，DcCath-H，DcCath-K，DcCath-L，DcCath-L1，DcCath-O和DcCath-W，均属于半胱氨酸蛋白酶。其中DcCath-H来源于柑橘木虱转录组数据，其他7个基因来源于NCBI数据库。序列分析发现7个组织蛋白酶基因均包含完整的编码区，仅DcCath-W为部分序列。氨基酸序列比对结果表明DcCath-B，DcCath-F，DcCath-H，DcCath-K，DcCath-L，DcCath-L1及DcCath-O均含有不同长度的信号肽。同时7种组织蛋白酶均含有保守的组氨酸活性位点，且Cys-His-Asn(C-H-N)催化三联体的氨基酸残基在所有的组织蛋白酶中均高度保守(图1)。

2.3 吡虫啉亚致死浓度对柑橘木虱成虫组织蛋白酶表达量的影响

吡虫啉LC20和LC50浓度处理柑橘木虱成虫24 h后检测8种组织蛋白酶转录水平表达量变化。吡虫啉亚致死浓度胁迫后，柑橘木虱成虫4种组织蛋白酶DcCath-H，DcCath-K，DcCath-O和DcCath-W基因表达水平无显著变化；而DcCath-B，DcCath-F，DcCath-L和DcCath-L1基因表达量显著降低。其中LC20处理24 h后DcCath-B，DcCath-L和DcCath-L1表达量分别下调72.64%，18.67%和13.53%。LC50浓度处理柑橘木虱成虫24 h后DcCath-B，DcCath-F，DcCath-L和DcCath-L1表达量分别下调64.65%，36.84%，15.27%和37.59%(图2)。

图2 吡虫啉亚致死浓度对柑橘木虱成虫组织蛋白酶基因表达水平的影响Fig.2 Effect of imidacloprid with sublethal concentration treatments on the mRNA expression level of eight cathepsins in Diaphorina citri adults注：CK，对照组；Im-LC20，吡虫啉LC20浓度处理组；Im-LC50，吡虫啉LC50浓度处理组。Note:CK,Control group;Im-LC20,Imidacloprid treatment group under LC20 concentration;Im-LC50,Imidacloprid treatment group under LC50 concentration.

2.4 毒死蜱亚致死浓度对柑橘木虱成虫组织蛋白酶表达量的影响

毒死蜱LC20和LC50浓度处理柑橘木虱成虫24 h后对8种组织蛋白酶mRNA水平表达量变化进行检测。毒死蜱亚致死浓度对柑橘木虱成虫5种组织蛋白酶DcCath-F，DcCath-H，DcCath-K，DcCath-L1和DcCath-O基因水平表达量无显著影响；而DcCath-B，DcCath-L和DcCath-W基因表达量显著下调。其中LC20处理24 h后DcCath-B，DcCath-L和DcCath-WmRNA水平表达量分别下调73.47%，24.23%和34.37%。LC50浓度处理柑橘木虱成虫24 h后DcCath-B表达量下调69.51%(图3)。

图3 毒死蜱亚致死浓度对柑橘木虱成虫组织蛋白酶基因转录水平的影响Fig.3 Effect of chlorpyrifos with sublethal concentration treatments on the mRNA expression level of eight cathepsins in Diaphorina citri adults注：CK，对照组；Ch-LC20，毒死蜱LC20浓度处理组；Ch-LC50，毒死蜱LC50浓度处理组。Note:CK,Control group;Ch-LC20,Chlorpyrifos treatment group under LC20 concentration;I Ch-LC50,Chlorpyrifos treatment group under LC50 concentration.

3 结论与讨论

柑橘木虱是柑橘黄龙病的主要传播媒介，其种群扩散对柑橘产业的发展造成严重威胁。目前化学防治是防治柑橘木虱的主要手段之一(曹旭等,2020)。有机磷类、拟除虫菊酯类、新烟碱类等广谱性杀虫剂以及应用于滴灌及树干施用的杀虫剂是目前田间防控柑橘木虱的常用药剂(Liuetal.,2020)。本研究采用新烟碱类杀虫剂吡虫啉和有机磷类杀虫剂毒死蜱对柑橘木虱成虫进行毒力测定,结果表明吡虫啉对柑橘木虱成虫的室内毒力较毒死蜱差，可能与药剂作用方式及调查统计时间较短(24 h)有关。

组织蛋白酶是生命有机体溶酶体中重要的水解酶系，在哺乳动物和人中的研究较为透彻，但到目前为止仅有少数昆虫组织蛋白酶基因得到充分鉴定。例如：通过对家蚕SilkDB数据库进行筛选，共鉴定得到13条组织蛋白酶基因，进一步分析结果表明这些基因分别属于Cath-B，Cath-F，Cath-L，Cath-K和Cath-O5种组织蛋白酶基因类型(李懿等,2015)。通过转录组测序结合克隆方法在二化螟Chilosuppressalis中鉴定得到8个组织蛋白酶基因，序列分析发现其分别属于Cath-B，Cath-F，Cath-L和Cath-O基因类型(Geetal.,2014)。Martynovetal.(2015)通过基因组结合转录组分析在黄粉虫Tenebriomolitor和赤拟谷盗Triboliumcastaneum中分别鉴定得到29和25个组织蛋白酶基因,其中黄粉虫组织蛋白酶基因分属于Cath-B，Cath-F，Cath-L和Cath-O，而在赤拟谷盗中除上述4种类型基因外还鉴定得到1个Cath-K基因(Martynovetal.,2015)。目前柑橘木虱中已报道的组织蛋白酶基因仅有4种，分别为DcCath-B，DcCath-L，DcCath-L1和DcCath-O。本研究通过NCBI数据库搜索及转录组数据Blast比对共得到8个柑橘木虱组织蛋白酶基因，其中具有完整编码区的7个蛋白均含有保守的Cys-His-Asn(C-H-N)催化三联体的氨基酸残基以保证功能的保守性。这为后续进一步深入探究柑橘木虱组织蛋白酶信息及功能，并以其作为农药新靶标提供理论基础。研究发现组织蛋白酶在昆虫生长发育、消化、繁殖、变态及免疫防御等生命过程中发挥重要作用(Saikhedkaretal.,2015)。通过RNAi等技术抑制或干扰组织蛋白酶基因的表达导致昆虫生长发育异常及死亡等现象发生。例如家蚕中沉默BmCath-B或BmCath-D均会导致变态过程中的化蛹延迟或异常(Guietal.,2006;Wangetal.,2010)。甜菜夜蛾Spodopteraexigua5龄幼虫经dsRNA-SeCath-D处理后化蛹出现异常且死亡率高达25%(Kangetal.,2017)。植物介导的RNAi对桃蚜Myzuspersicae组织蛋白酶基因MpCath-L进行沉默后桃蚜成虫死亡率达到80%，同时成虫繁殖率显著降低且若虫发育延缓(Raufetal.,2019)。在后期的防治中，可通过RNAi等技术对柑橘木虱各组织蛋白酶基因进行人为的干预，通过抑制其活性来改变柑橘木虱的生长发育等生理过程，进而达到防治效果。

另外，作为一类多功能酶系，昆虫组织蛋白酶同样参与昆虫对外界压力的响应(Saikhedkaretal.,2015;吴凡等,2017)。研究表明高温胁迫诱导昆虫组织蛋白酶上调表达。例如，家蚕5龄幼虫高温(28℃)处理后化蛹过程明显快于对照组(23℃)，northern blot结果表明高温处理组Bm-Cath-D表达量显著高于对照组，推测Bm-Cath-D在高温胁迫下对家蚕加速化蛹过程具有重要作用(Kimetal.,2011)。柑橘木虱成虫受高温(40℃)胁迫时组织蛋白酶DcCath-B，DcCath-F，DcCath-L转录水平同样显著上调表达(Shuetal.,2020)。此外，昆虫组织蛋白酶在病毒侵染昆虫过程中具有重要作用。登革热病毒(DENV)侵染埃及伊蚊Aedesaegypti过程中，唾液腺和中肠AaCath-L的表达量与登革热病毒DENV2效价呈负相关，而在埃及伊蚊3个品系(Cali-S，Cali-MIB及Rockefeller)中采用dsRNA干扰AaCath-B的表达则能够显著降低DENV2侵入的埃及伊蚊比例(Caicedoetal.,2019;Oliveiraetal.,2020)。再者，昆虫组织蛋白酶参与昆虫对杀虫剂的响应。例如苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisBerliner(Bt)亚致死浓度处理松墨天牛MonochamusalternatusHope 20 h后组织蛋白酶基因MaCath-L下调表达(Linetal.,2016)。进一步研究发现Bt产生的Cry毒素通过促进桃蚜组织蛋白酶MpCath-B的活性发挥毒性(Zhaoetal.,2020)。而印楝素A饲喂桔小实蝇Bactroceradorsalis7 d中肠组织蛋白酶基因BdCath-D，BdCath-F和BdCath-L则显著上调表达，推测3种组织蛋白酶可能在印楝素诱导桔小实蝇中肠组织细胞凋亡中发挥重要作用(Zhaoetal.,2019)。本研究通过室内毒力测定得到吡虫啉和毒死蜱对柑橘木虱成虫的亚致死浓度LC20和LC50，并采用荧光定量PCR技术检测组织蛋白酶在亚致死浓度下mRNA表达水平的变化。结果表明部分组织蛋白酶基因在吡虫啉和毒死蜱亚致死浓度胁迫下转录水平表达量显著下调，其中DcCath-B转录水平表达量受亚致死浓度吡虫啉和毒死蜱影响最大，推测两种药剂可能扮演DcCath-B抑制剂调控组织蛋白酶的变化，从而发挥对柑橘木虱成虫的毒性。

综上，本研究通过转录组数据及NCBI数据库鉴定出8种柑橘木虱组织蛋白酶基因，为设计以组织蛋白酶为新作用靶标的柑橘木虱防控新型农药创制提供相应的序列信息。同时本研究从转录水平探究了亚致死浓度吡虫啉和毒死蜱胁迫对柑橘木虱成虫组织蛋白酶基因表达的影响。以上研究结果为探究亚致死浓度吡虫啉和毒死蜱对柑橘木虱的毒理机制提供一定的理论基础。具体柑橘木虱组织蛋白酶在柑橘木虱响应亚致死浓度吡虫啉和毒死蜱过程中的功能仍需进一步研究。