豇豆轻斑驳病毒CPMMV感染菜豆对B型烟粉虱寄主选择和生物学特性的影响

杨春晓，YUAN Ling，ZHOU Xu-Guo*，刘 勇

(1.华南农业大学/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广州 510642；2.University of Kentucky,Lexington,KY,USA 40546；3.湖南省农业科学院植物保护研究所，园艺作物病虫害综合治理湖南省重点实验室，长沙 410125))

EffectsofCowpeamildmottlevirusinfectiononhostselectionandbiologicalcharacteristicofBemisiatabaciBbiotype

YANG Chun-Xiao1,YUAN Ling2,ZHOU Xu-Guo2*,LIU Yong3*(1.South China Agricultural University,State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources,Guangzhou 510642,China;2.Department of Entomology,University of Kentucky,Lexington,KY,USA 40546;3.Hunan Academy of Agricultural Sciences,Institute of Plant Protection,Changsha 410125,China)

Abstract:The epidemiology ofCowpeamildmottlevirus(CPMMV) is closely associated with its vector whitefly,BemisiatabaciB biotype.However,the effects of CPMMV infection of host plant on host selection and biological characteristic ofB.tabaciB biotype remain unexplored.In this study,we analyzed:1) the effect of CPMMV infection ofPhaseolusvulgarisat different time points on host selection and oviposition preference ofB.tabaciB biotype;2) the effects of CPMMV infection on biological characteristic ofB.tabaciB biotype.Our results showed that:1) compared with healthyP.vulgaris,B.tabaciB biotype preferred to stay and lay eggs on CPMMV-infectedP.vulgaris.However,for the experiment conducted on the four weeks old plants after CPMMV inoculation,B.tabaciB biotype preferred to stay on healthy plants and lay eggs;2)B.tabaciB biotype had no difference in fecundity and survival rates between healthy and CPMMV-infected plants at 1 and 4 weeks after CPMMV inoculation.In conclusion,CPMMV infection ofP.vulgarishad a time effect on the host preference ofB.tabaciB biotype,but CPMMV infection ofP.vulgarishad no significant effect on the biological characteristics ofB.tabaciB biotype.

Keywords:Cowpeamildmottlevirus;B.tabaciB biotype;host selection;biological characteristic

豇豆轻斑驳病毒(Cowpeamildmottlevirus，CPMMV)是正单链RNA病毒，病毒粒子为弯曲的丝状颗粒(约650 nm×15 nm)，与香石竹潜隐病毒属Carlavirus的其它病毒类似，有一大小为31～33 kDa的外壳蛋白。该属病毒能使多种作物减产10%～15%，而且还常与其它病毒发生复合侵染，使危害加剧(Naiduetal.,1998;Britoetal.,2002;Tavasolietal.,2009)。根据2011年病毒分类国际委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)正式出版的病毒分类报告第九版《Virus Taxonomy:Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses》，CPMMV在分类地位上属于芜菁黄花叶病毒目Tymovirales乙型线状病毒科Betaflexiviridae香石竹潜隐病毒属Carlavirus(King,2012)。

1973年，Brunt等首次报道了，在加纳CPMMV能在豇豆VignaunguiculataL.上引起系统性斑点、褪绿以及叶片畸形等症状(Brunt and Kenten,1973)。随后，在非洲、亚洲、巴西和阿根廷以及象牙海岸等地的多个热带地区(Thouveneletal.,1982;Mink and Keswani,1987;Antignus and Cohen,1987;Reddy,1991;Weietal.,2020)都有了该病毒的报导。CPMMV除侵染豆科外，还可侵染藜科、葫芦科、苋科和茄科的多种植物。自然条件下感染CPMMV的豇豆，表现出轻微的整株斑驳。若单凭在豇豆植株上表现出症状的严重程度，很难准确评估该病毒造成经济损失，但是在亚洲、非洲、美洲的许多热带国家中，豇豆经常与其它重要的豆科作物，如花生ArachishypogaeaLinn.、大豆Glycinemax、绿豆Vignaradiata等间作，因此CPMMV仍被视为对豆科植物的重大威胁(El-Hassanetal.,1997;Salemetal.,2010)。

在烟粉虱隐种中，MEAM1(B)和MED(Q)隐种在世界范围内发生危害最为严重。烟粉虱为害最严重的是因其取食以及传播众多的植物病毒，对农作物和观赏植物造成了巨大的经济损失(Brown and Czosnek,2002;Panetal.,2012)。烟粉虱传播的病毒，90%属于菜豆金黄花叶病毒属，约288种病毒(Polstonetal.,2014;Gilbertsonetal.,2015)，被认为对农作物的生长和产量最具威胁。研究发现，香石竹潜隐病毒属的大多数病毒主要由蚜虫传播，大约有50种(Polstonetal.,2014)，已被证实的两种由烟粉虱传播的该属病毒为CPMMV和甜瓜泛黄相关病毒(Melonyellowing-associatedvirus，MYaV)。

针对烟粉虱传播的具有持久性传播方式的番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)，近几年的研究发现，Q型烟粉虱停留在感染了TYLCV的曼陀罗DaturastramoniumL.植株上的数量要显著的高于在健康植株上的停留数量，Q型烟粉虱在感染了TYLCV病毒的曼陀罗上的产卵量显著的高于在健康植株上的产卵量(Chenetal.,2013)。另外，通过比较无毒B型烟粉虱、带毒B型烟粉虱(携带TYLCV)、无毒Q型烟粉虱以及带毒Q型烟粉虱(携带TYLCV)对健康番茄Lycopersiconesculentum以及TYLCV感染的带毒番茄选择的喜好，研究发现无毒的B型烟粉虱喜好健康番茄植株，而无毒的Q型烟粉虱则喜好带TYLCV的感病植株，然而，当B型烟粉虱与Q型烟粉虱携带了TYLCV之后，发现它们对健康番茄与发病番茄植株没有明显的选择偏好(Fangetal.,2013)。

病毒感染寄主植物后的不同时期，寄主植物在颜色、气味以及营养组成等方面都会不同，进而会对媒介昆虫产生不同的影响。本文以烟粉虱及其传播的半持久性/非持久性病毒，CPMMV为研究对象，探讨CPMMV感染的菜豆在不同时间点，对于烟粉虱寄主选择和生物学特性的影响。

1 材料与方法

1.1 室内烟粉虱种群和寄主植物

2014年，从美国肯塔基州列克星敦市的棉花Gossypiumspp.、向日葵HelianthusannuusL.和番茄Lycopersiconesculentum上采集了烟粉虱样本，经mtCOI测序、SCAR引物鉴定后确认为B型烟粉虱(Panetal.,2011)，以棉花上采集的B型烟粉虱在菜豆上建立种群，随后饲养在玻璃温室中，环境温度为26±2℃。本试验所用植物为菜豆Phaseolusvulgaris，栽培品种为‘Topcrop’。菜豆种植在步入式植物生长箱中，试验在肯塔基州的烟草研究和发展中心完成(Kentucky Tobacco Research and Development Center)。

1.2 CPMMV的人工接种及鉴定

本试验所用植物为菜豆，栽培品种为‘Topcrop’。CPMMV感染的菜豆叶片由美国佛罗里达大学植物病理系的Jane E.Polston教授提供。通过低温邮寄，而后存放于-20℃冰箱。

1.2.1人工摩擦接种CPMMV

先准备好研钵与研棒、纱布、洗瓶、金刚砂、0.1 mol/L pH 7.2的磷酸缓冲液、标签、记号笔等。当菜豆长到两个真叶期，用于接种试验。实验过程：(1)剪取小块含病毒或健康的叶片(1 g)，分别放在1个研钵中并加入适量磷酸缓冲液(10 mL)和少许金刚砂，研磨成糊状。(2)用手指蘸取少量病样或健康汁液在叶面上轻抹2～3次，之后用洗瓶内的水清洗叶面。另外在营养钵中插入标签，注明接种日期和接种人，每3天观察一次发病情况，注意接种CPMMV的叶片和对照植物叶上的症状是否一致。

1.2.2CPMMV的RT-PCR鉴定

RNA的提取及反转录：应用TRIzol的方法提取菜豆植物叶片的RNA，然后取1 μg总RNA应用M-MLV反转录试剂盒和引物oligo (dT)21进行反转录，得到的cDNA用于下游的PCR，反应前存放于-20℃保存。应用鉴定香石竹潜隐病毒属的引物5′-GGBYTNGGBGTNCCNCANGA-3′和oligo (dT)21进行CPMMV的PCR鉴定(Gasparetal.,2008)。PCR反应体系20 μL，包括ddH2O 7.0 μL，PCR Mix 10.0 μL，上下游引物各1.0 μL，模板1 μL。PCR程序设置：94℃预变性5 min，35个循环；94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min。循环结束后72℃延伸5 min，8℃保存。

1.3 带毒菜豆植株的获取

应用上述的CPMMV的人工接种方法，摩擦接种2片真叶期的菜豆植株。植物置于温度为26±2℃，16 L ∶8 D，相对湿度为70%的步入式植物生长箱中生长，取摩擦接种后第1周和第4周的植株，经RT-PCR检测证实感染病毒的植株用于试验。

1.4 B型烟粉虱对健康和CPMMV感染的菜豆寄主选择性测定

B型烟粉虱对寄主植物选择行为的设计按照Omondietal.(2005)的方法开展。将大小一致，接种后第1周或第4周健康和感染CPMMV的菜豆植株分别放置在一个纱网笼(60 cm×60 cm×60 cm)的相对角落。分别在每个笼子的中心底部释放大约50头烟粉虱成虫。并在释放烟粉虱1、3、6、24、48、72和96 h，分别统计在每株植株上的虫数。96 h后，在体式显微镜(Olympus SZ61)下对每株菜豆所有叶片上的卵进行计数。每个处理3个重复，共6个实验重复笼。这些笼子放置于自然光照和自然环境温度(26±2℃)的温室中。

1.5 B型烟粉虱在健康和CPMMV感染植株上生物学特性的比较

本试验对B型烟粉虱在健康和感染CPMMV的菜豆上的存活率和产卵量进行了的比较，设置4个处理，B型烟粉虱+摩擦接种无毒叶片第1周的健康菜豆、B型烟粉虱+摩擦接种无毒叶片第4周的健康菜豆、B型烟粉虱+摩擦接种CPMMV第1周的感病菜豆、B型烟粉虱+摩擦接种CPMMV第4周的感病菜豆，每处理初始设置20个重复。取羽化3 h内的B型烟粉虱，在解剖镜下鉴别雌雄后，取雌虫分别转接到夹在摩擦接种后第1周和第4周的健康和发病菜豆中部叶片上的微虫笼中，每笼1头雌虫。每株菜豆夹2个微虫笼。每天观察烟粉虱的存活，连续观察7 d。7 d后在解剖镜下观察记录叶片上的卵数。

1.6 数据分析

应用重复测量方差分析比较B型烟粉虱在不同时间点停留在健康和感染CPMMV的菜豆上的差异。应用单因素方差分析比较B型烟粉虱在健康和感染CPMMV菜豆上的产卵量。当方差显著时，再用LSD法对平均值进行多重比较。百分比数据在比较前先进行反正弦平方根转换。存活率的比较应用卡方检验，产卵量的比较应用单因素方差分析。用SPSS 21.0统计软件进行分析，取0.05显著性水平。

2 结果与分析

2.1 MtCOI测序、SCAR方法鉴定烟粉虱隐种结果

应用mtCOI SCAR引物对采集自棉花、向日葵和番茄上的烟粉虱鉴定后发现，全部为B型烟粉虱。B型烟粉虱引物能稳定扩增出478 bp的条带；而Q型烟粉虱引物则没有扩增出条带(图1)。

图1 应用烟粉虱mtCOI特异性引物鉴定烟粉虱隐种Fig.1 Applying of mtCOI species-specific primers to distinguish the Bemisia tabaci species注：M，标准DNA分子量；PCR反应的模板为：3头从棉花上采集的烟粉虱；3头从向日葵上采集的烟粉虱；3头从番茄上采集的烟粉虱。Note:M,Marker;Templates in the PCR reactions were as follows:Three B. tabaci individuals from cotton;Three B. tabaci individuals from sunflower;Three B. tabaci individuals from tomato.

对上述应用mtCO1 SCAR引物扩增得到的PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后，送公司进行双向测序。将测序得到的序列进行拼接、NCBI比对后，进一步验证了所采集到的烟粉虱为B型烟粉虱。随后，建立了从棉花上采集到的B型烟粉虱菜豆种群。

2.2 感染CPMMV菜豆的发病症状

CPMMV侵染菜豆后，叶片表现系统性的斑驳，尤其是感病时间较长的植株上部叶片出现黄化症状(图2)。

图2 CPMMV感染菜豆植株后的典型症状Fig.2 Typical sysptom of Phaseolus vulgaris infected by CPMMV

2.3 CPMMV的PCR鉴定

应用香石竹潜隐病毒属的引物进行PCR诊断，可以准确的判断菜豆植株的CPMMV的感染(图3)。1、2、3、5为接种CPMMV感染叶片的植株；4、6、7、8为接种健康叶片的植株；9、10为Jane E.Polston教授提供的CPMMV感染的菜豆叶片；11、12、13为健康植株(图3)。

图3 应用RT-PCR方法检测菜豆感染CPMMV的状态Fig.3 Using the method of RT-PCR to detect the CPMMV infection status of Phaseolus vulgaris注：M，标准DNA分子量；PCR反应的模板为：1，2，3，5为接种CPMMV感染叶片的植株；4，6，7，8为接种健康叶片的植株；9，10为Jane E.Polston提供的CPMMV感染的植株叶片；11，12，13为健康植株叶片。Note:M,Marker;Templates in the PCR reactions were as follows:1,2,3,5 were the plants inoculated by CPMMV-infected leaves;4,6,7,8 were the plants inoculated by healthy leaves;9,10 were the CPMMV-infected leaves that provided by Jane E.Polston;and 11,12,13 were the healthy leaves.

2.4 B型烟粉虱对健康和CPMMV感染的菜豆寄主选择性

在摩擦接种CPMMV后第1周的植株上，在任何一个时间点，CPMMV感染菜豆上的B型烟粉虱成虫的数量都显著的高于在健康植株上(F1,4=23.473,P=0.008)(图4)。96 h后，在感染了CPMMV的菜豆植株上，B型烟粉虱的总产卵量要高于在健康植株上的总产卵量(F1,4=3.611,P=0.130)(图5)。

图4 B型烟粉虱对健康菜豆和接种CPMMV病毒1周后感病菜豆植株的选择Fig.4 Host selection of Bemisia tabaci B biotype on healthy and CPMMV-infected one week old Phaseolus vulgaris注：图中数值为平均值±标准误。下图同。Note:Values were means±SE.Same below.

图5 B型烟粉虱在健康菜豆和接种CPMMV病毒1周后的感病菜豆植株上产卵量Fig.5 Number of eggs (mean±SE) laid by Bemisia tabaci B biotype on healthy and CPMMV-infected one week old Phaseolus vulgaris in a choice test

然而，在摩擦接种CPMMV后4周的植株上，寄主选择与产卵的结果与接种第1周后植株上的试验结果完全相反。结果显示，在任意一个时间点，B型烟粉虱停留在健康菜豆植株上的数量要显著高于在CPMMV感染的植株上的数量(F1,4=206.170,P<0.0001)(图6)。96 h后，在健康植株上B型烟粉虱的总产卵量显著高于在感染了CPMMV病毒的植株上的总产卵量(F1,4=32.905,P=0.005)(图7)。

图6 B型烟粉虱对健康菜豆和接种CPMMV病毒4周后的感病菜豆植株选择Fig.6 Host selection of Bemisia tabaci B biotype on healthy and CPMMV-infected four weeks old Phaseolus vulgaris

图7 B型烟粉虱在健康菜豆和接种CPMMV病毒4周后的感病菜豆植株上的产卵量Fig.7 Number of eggs (mean±SE) laid by Bemisia tabaci B biotype on healthy and CPMMV-infected four weeks old Phaseolus vulgaris in a choice test

2.5 B型烟粉虱在健康和CPMMV感染植株上生物学特性的比较

摩擦接种CPMMV后1周，B型烟粉虱的产卵量在健康和感染CPMMV的植株上差异不显著(F1,36=1.162,P=0.288)(图8-A)。另外，B型烟粉虱在健康和感染CPMMV的植株上的存活率也无显著差异(χ2=1.579,P=0.209)(图8-B)。

图8 B型烟粉虱雌虫在接种后第1周的健康和感染CPMMV的菜豆上的产卵量(A)和存活率(B)Fig.8 Fecundity (A) and survival rate (B) of Bemisia tabaci B biotype females on one week old healthy vs.CPMMV-infected Phaseolus vulgaris after inoculation

摩擦接种CPMMV后4周，B型烟粉虱的产卵量在健康和感染CPMMV的植株上无显著差异(F1,31=0.003,P=0.958)(图9-A)。另外，B型烟粉虱在健康和感染CPMMV的植株上的存活率也差异不显著(χ2=0.105,P=0.746)(图9-B)。

图9 B型烟粉虱雌虫在接种后第4周的健康和感染CPMMV的菜豆上的产卵量(A)和存活率(B)Fig.9 Fecundity (A) and survival rate (B) of Bemisia tabaci B biotype females on four weeks old healthy vs.CPMMV-infected Phaseolus vulgaris after inoculation

3 结论与讨论

本试验通过mtCOI测序和SCAR方法明确了从棉花、向日葵及番茄上采集到的烟粉虱为B型烟粉虱，建立了从棉花上采集的，进而饲养在菜豆上的B型烟粉虱种群。McKenzie等(2012)对2005年1月-2011年12月从美国、百慕大群岛、加拿大和墨西哥多种植物上采集到的208组样本进行了烟粉虱隐种鉴定。结果发现，71%的样本至少有1头 B型烟粉虱，53%的样本仅含有B型烟粉虱。Q型烟粉虱从美国23州采集的样本中均有发现，且仅在保护地中的植物上发现，在大田植物上没有检测到Q型烟粉虱。本试验采集的3个B型烟粉虱种群都是从田间采集的，所以，也验证了在美国田间植物上发生的烟粉虱为B型，至今还没有Q型烟粉虱在美国大田发生为害的报道(McKenzieetal.,2012)。

本研究表明，在摩擦接种后第1周和第4周健康和发病的菜豆植株上，B型烟粉虱的寄主选择和产卵偏好性有显著的差别。摩擦接种后第1周时，B型烟粉虱喜好在CPMMV感染的植株上停留和产卵；然而，摩擦接种后第4周时，B型烟粉虱偏好在健康的植株上停留和产卵。这些数据表明，CPMMV侵染菜豆对于传播媒介B型烟粉虱选择寄主植物的偏好性影响具有时间效应。本试验的目的是探究半持久性/非持久性传播的病毒CPMMV侵染寄主菜豆后的不同时间对于媒介昆虫B型烟粉虱寄主选择行为和产卵行为的影响。当前，仅Legarrea等(2015)的研究发现，TYLCV侵染番茄植株对于B型烟粉虱的寄主选择行为和适合度的影响具有时间效应。然而，到目前为止，还没有关于半持久性/非持久性传播的病毒侵染寄主植物的不同时期对于传毒昆虫是否具有时间效应的报道。本研究表明，在摩擦接种后第1周和第4周的健康和感染CPMMV的植株上，B型烟粉虱的寄主选择行为和产卵偏好性有显著的差别。已有的研究表明，嗅觉线索在昆虫对寄主植物的选择过程中发挥着重要作用，而这与植物的次生代谢产物密切相关(Kessleretal.,2001;Chenetal.,2007;Suetal.,2018)。次生代谢产物包括萜烯类化合物、黄酮类化合物、苯丙素类、酚类物质、蜡质、其它硫化物/含氮化合物等(Karbanetal.,1999;Yangetal.,2020)。在植物的抗病反应中，次生代谢产物不仅可以作为生化壁垒抵抗病原物的侵染，还能作为信号物质参与植物的抗病反应。次生代谢产物通常还决定着植物的颜色、气味和味道，从而使植物对昆虫具有趋避或吸引作用(Karbanetal.,2014;Suetal.,2018)。另外，CPMMV侵染菜豆后可能会影响其营养物质如游离氨基酸、碳水化合物、氮磷钾等发生变化(Jiaoetal.,2012;2018;Guoetal.,2019)，进而影响B型烟粉虱的寄主选择和生物学特性。因此推测，在病毒侵染寄主的不同时间点，烟粉虱对于寄主的选择偏好性差异可能与寄主次生代谢产物和营养物质种类与含量变化有关。这些推测需要进一步的挥发物检测、营养物质含量变化试验以及转录组信息来加以验证。另外，这些结果还表明，单凭在一个时间点获得的病原物与宿主昆虫互作的结论是有局限性的。今后，在研究不同组合的寄主植物、植物病毒及传毒昆虫的互作时，时间因子必须要考虑进去，这样得到的结论才更为可信。此外，本试验的结果有助于更好的理解相关因子(如感染病毒后的不同时间)如何驱动烟粉虱传播的CPMMV的暴发流行。

本研究表明，在摩擦接种CPMMV后1周和4周的植株上，B型烟粉虱在健康和感染CPMMV的植株上的产卵量和存活率均无差别。但有趣的是，摩擦接种后1周，较健康植株，B型烟粉虱在CPMMV感染的植株上的产卵量和存活率相对高些；而摩擦接种后4周，B型烟粉虱在健康和CPMMV感染的植株上的产卵量和存活率相对持平。这些数据表明，CPMMV侵染菜豆植株对传播媒介昆虫B型烟粉虱的生物学特性影响具有较弱的时间效应。感染病毒的植物可以影响传毒昆虫的生物学，很多研究表明传毒昆虫在健康和感病植株上的生物学特性有差异。目前，病毒感染寄主植物对于媒介昆虫的适合度研究是在很多昆虫、病毒及寄主植物的不同组合下开展的(Stoutetal.,2006;Weietal.,2019;Lietal.,2019;Wanetal.,2020)，但遗憾的是，在几乎所有的三者互作试验中，仅选用了病毒侵染寄主植物后的一个时间点去研究。然而，因病毒侵染寄主植物后的不同时期，寄主植物在表型、气味、营养以及防御机制等方面都会不同，那么，早期的研究就不能全面并系统的弄清楚病毒侵染寄主植物后到底是对媒介昆虫有利、中性或有害。如TYLCV侵染番茄植株对于B型烟粉虱的选择和发育的影响具有时间效应。较健康植株，B型烟粉虱喜好在TYLCV侵染6周的番茄上停留和产卵，而对于TYLCV侵染3周和12周的植株，B型烟粉虱的停留和产卵均无偏好性(Legarreaetal.,2015)。

CPMMV的寄主植物范围广泛，今后开展更多的关于CPMMV、B型烟粉虱以及不同寄主植物的互作研究，比较不同组合条件下互作关系的异同，可为CPMMV的暴发流行提供更多的实验证据。