梨花和油菜花朵特征对蜜蜂访花偏爱性的影响

张江超，刘 强，黄家兴，高 飞，陈 敏，马卫华，姜玉锁*

(1.山西农业大学动物科学学院，山西太谷 030801；2.延安市桥北国有林管理局，陕西延安 716000；3.中国农业科学院蜜蜂研究所，农业部传粉昆虫生物学重点实验室，北京 100093；4.山西农业大学园艺学院，太原 030031)

蜜蜂是广泛高效的传粉者。研究表明蜜蜂授粉可提高番茄Lycopersiconesculentum的坐果率，降低畸形果率(尤春等,2020)；可显著提高子莲NelumbonuciferaGaertn.的产量和品质(赵东绪等,2018)；可极显著提高蓝莓Vacciniumspp.坐果率，提升果实的风味品质(赵东绪等,2019)；在对蜜蜂为梨树授粉效果的研究时也发现蜜蜂可以提高产量(吴美根等,1984)。

当传粉昆虫访花时，出现连续采集某一种特定类型的花朵的反应，昆虫对此类型的花朵的选择行为，称为“访花偏爱性”(Gegearetal.,2004)。研究表明，传粉昆虫对花朵的偏爱性与花朵特征：大小、颜色、形态、气味，花粉、花蜜质量及环境等因素有关(官昭瑛等,2005;施海燕等,2008;罗文华等,2015;罗文华等,2019)。蜜蜂喜欢采集饲料报酬更高的花，获得营养物质(Anna-Karin,1990)。影响访花偏爱性的因素可以作为花朵饲料报酬高低的信号影响蜜蜂的拜访(龙登隆,2019)。

梨树是异花虫媒植物，配子体型自交不亲和。

自花授粉时，不能结实，且存在异花授粉不亲和现象(Hiratsukaetal.,2002)。到现在为止，梨产区仍主要依靠人工授粉、喷雾器喷花等方式(武文卿等,2017;曹慧莲等,2020)。这种方式虽然授粉效果较好，但耗时耗力，浪费人力，并且可能会错过最佳授粉时间。新疆出现无人机雾化喷洒的授粉方式，适用于大面积的果园(倪菁菁等,2020)。

蜜蜂对梨花Pyrusspp.访花偏爱性较差，这可能与梨花花朵的颜色、大小、气味以及梨花花粉粒的重量、湿度、粘性和花蜜的营养价值、质量有关(Abroletal.,1988;Orosz-Kovacsetal.,2003;武文卿等,2011)。除此之外，当梨树周围有同花期植物如油菜时，蜜蜂的访花积极性也会下降(付宝春等,2018)。

本研究通过开展蜜蜂访花偏爱性试验,对同花期植物花朵特征：花蜜的糖含量、花粉中18种氨基酸含量以及挥发性物质进行检测和分析，探讨蜜蜂不偏爱采集梨花的原因，为下一步诱导蜜蜂为梨树授粉提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料：试验在运城盐湖区生态梨园进行。试验用花蜜和花粉分别采自砀山酥梨PyrusbretshneideriDangshan、巴梨PyruscommunisBartlett、黄梨PyrusbretschneideriHuang和油菜BrassicacampestrisL.。

供试蜂群：意大利蜜蜂Apismelliferaligustica。

1.2 试验方法

1.2.1访花偏爱性试验

以访花蜜蜂数量和蜜蜂访花频率作为研究蜜蜂访花偏爱性的指标。选取长势相当的砀山酥梨、巴梨、黄梨梨树各1棵，并在油菜田中随机选取一块1 m×1 m的试验区域进行标记；盛花期分别在选定的梨树和油菜试验区域各选取 40个梨花花序、30个油菜花花序作为样方(样方内折合花朵数均约200朵)(何承刚等,2005;邵长凯等,2015)。

1.2.1.1 访花蜜蜂数量

访花蜜蜂数量是指在单位时间内探访样方内花朵的蜜蜂总数(马卫华,2014)。试验采用直接计数法，记录1 h内探访样方内花朵的蜜蜂数量。

1.2.1.2 访花频率

访花频率是指每分钟蜜蜂访问的花朵数。访花频率的观测于盛花期(花蕾完全开放、花药已散粉)进行。采用样方法和追踪法，从7 ∶00-17 ∶00，记录每小时前5 min蜜蜂在样方内的访花状况。以一头采集蜂为一个样本，用计时器记下其访花过程所用时间。样本量至少60头。以计数器记下访花数量(龚燕兵等,2007)。

访花频率=访花数量/访花时间

1.2.2花蜜糖含量的测定

毛细管法采集花蜜(Corbet,2003;李左栋等,2006)，液相色谱示差折光检测法检测花蜜中的葡萄糖、麦芽糖、果糖和蔗糖含量(张书芬等,2008)。

1.2.3花粉氨基酸含量的测定

采集气球期的花朵，待阴干散粉，收集花粉(何子顺,2006)；参照国家标准GB/T5009.124-2003检测花粉中18种氨基酸含量(中国国家标准化管理委员会,2003;张金振等,2014;牛德芳等,2019)。

1.2.4花朵挥发性物质的测定

按照马卫华等进行挥发性物质检测(马卫华等,2018)。

1.3 数据分析

通过SPSS(Statistical Product and Service Solutions)软件中的Duncan氏多重比较进行方差分析，结果以平均值±标准差表示，采用GraphPad Prism 5、Microsoft Excel 2019进行图形分析；通过气相色谱-质谱-计算机联用仪、NIST标准谱图库，定性分析质谱数据(张辉秀等,2013)；采用峰面积归一化法，求得各成分相对百分含量。

2 结果与分析

2.1 访花偏爱性

2.1.1访花蜜蜂数量

砀山酥梨、黄梨、巴梨和同花期竞争植物油菜的访花蜜蜂数量如图1。7 ∶00-8 ∶00时间段内，砀山酥梨的蜜蜂访问数量多于油菜；9 ∶00-17 ∶00，油菜的蜜蜂访问数量多于砀山酥梨；7 ∶00-17 ∶00，巴梨的访花蜜蜂数量多于黄梨和砀山酥梨。

图1 梨树和油菜的访花蜜蜂数量Fig.1 Number of flower-visiting honeybees in pears and rape

2.1.2访花频率

油菜的访花频率为(28.35 朵/min)显著高于砀山酥梨(11.72 朵/min)(P<0.05)；不同种梨花中，访花频率由高到低依次为：巴梨(19.91 朵/min)、黄梨(18.02 朵/min)、砀山酥梨(11.72 朵/min)，巴梨、黄梨显著高于砀山酥梨(P<0.05)(图2)。

图2 梨树和油菜的蜜蜂访花频率Fig.2 Flower-visiting frequency of honeybees in pears and rape注：不同字母表示差异显著(P<0.05)。Note:Different letters indicated significant differences (P<0.05).

2.2 花蜜糖含量

毛细管法采集花蜜，液相色谱示差折光检测法检测花蜜中的葡萄糖、麦芽糖、果糖和蔗糖含量，结果可知：梨花花蜜中3种糖含量为：葡萄糖含量均为最高，其次是果糖、蔗糖，麦芽糖未被检测到；不同梨花花蜜中的3种糖含量及总糖含量由高到低依次为：砀山酥梨、黄梨、巴梨。其中巴梨的蔗糖含量最少，仅为0.001 mg/mL，显著低于砀山酥梨(0.194 mg/mL)和黄梨(0.1115 mg/mL)(P<0.05)(表1)。

表1 3种梨花花蜜糖含量Table 1 Sugar composition and content of three kinds pear flower nectar

续表1 Continued table 1

2.3 花粉氨基酸含量及组分

砀山酥梨、黄梨、巴梨和油菜花粉总氨基酸含量、氨基酸各组分所占的比例分别见表2、图3。

图3 梨树和油菜花粉中氨基酸各组分所占的比例Fig.3 Percentage of amino acids in pollens of pears and rape

表2 梨树和油菜花粉中总氨基酸含量Table 2 Total amino acid content in pollens of pears and rape

砀山酥梨花粉中的总氨基酸含量最高(33.420 g/100g)，其次为黄梨(32.640 g/100g)，巴梨最少(8.550 g/100g)；油菜花粉总氨基酸含量为26.820 g/100g。3种梨花花粉的各氨基酸比例基本相同，巴梨Cys和Lys高于其他花粉的组分含量；砀山酥梨的Arg含量高于油菜。

2.4 花朵挥发性物质

固相微萃取-气质联用技术对黄梨、砀山酥梨、巴梨和油菜花朵中挥发性物质分析，采用峰面积归一化法对各组分进行定性和半定量分析，结果见表3；挥发性物质及占比分析见图4、图5。

2.4.1黄梨花朵挥发性物质

黄梨花朵共检测出7类21种挥发性物质：3种萜烯类化合物(14.76%)、2种芳香类化合物(2.67%)、5种酯类化合物(9.49%)、7种烷烃类化合物(17.88%)、2种腈类化合物(25.99%)、1种酮类化合物(20.84%)、1种醇类化合物(14.76%)。其中，腈类化合物总相对含量最多为25.99%。黄梨花朵中挥发性物质的主体成分有6,10,14-三甲基-2-十五烷酮(28.36%)、4,8,12-三甲基-3-十三碳烯腈(20.24%)、3,7,11,15-四甲基-1,6,10,14-十六碳四烯-3-醇(8.37%)、二十一烷(8.27%)、罗勒烯(6.57%)、5-十八烯(5.77%)等；次要成分有D-柠檬烯(2.42%)、萘(2.03%)等；修饰成分有2-甲基-3-羟基-2.4.4-三甲基丙酸甲酯(0.72%)等(表3、图4)。

2.4.2砀山酥梨花朵挥发性物质

砀山酥梨花朵共检测出7类21种挥发性物质：3种萜烯类化合物(19.02%)、2种芳香类化合物(6.19%)、5种酯类化合物(8.93%)、7种烷烃类化合物(34.45%)、2种腈类化合物(16.90%)、1种酮类化合物(6.40%)、1种醇类化合物(8.11%)。其中，烷烃化合物总相对含量最多为34.45%。砀山酥梨花朵中挥发性物质的主体成分有二十一烷(19.30%)，其次为5-十八烯(12.14%)、4,8,12-3甲基-3-十三碳烯腈(8.76%)、3,7,11,15-四甲基-1,6,10,14-十六碳四烯-3-醇(8.11%)等；次要成分有十五烷(2.96%)、罗勒烯(2.28%)等；修饰成分有2-甲基萘(0.97%)、4-羟基丁基丙烯酸酯(0.57%)等(表3、图4)。

2.4.3巴梨花朵挥发性物质

巴梨花朵共检测出9类28种挥发性物质：2种萜烯类化合物(40.86%)、2种醚类化合物(2.74%)、4种酯类化合物(9.02%)、1种酮类化合物(0.66%)、15种醇类化合物(40.04%)、1种酸类化合物(0.49%)、1种酰胺类化合物(0.71%)和其他类(5.48%)。其中，萜烯类化合物总相对含量最多为40.86%。巴梨花朵中挥发性物质的主体成分有(E,E,E)-3,7,11,15-四甲基己二酸-1,3,6,10,14-五烯(34.35%)、2-丁基辛醇(13.71%)、罗勒烯(6.51%)、3 -甲基-1-丁醇(6.22%)等；次要成分有苯乙醇(2.98%)、2-羟基戊酸甲酯(2.96%)等；修饰成分有2-乙基-1-己醇(0.94%)、二乙二醇乙醚(0.90%)等(表3、图4)。

2.4.4油菜花朵挥发性物质

油菜花朵共检测出6类22种挥发性物质：8种萜烯类化合物(40.23%)、2种芳香类化合物(5.54%)、4种酯类化合物(15.98%)、6种烷烃类化合物(30.10%)、1种腈类化合物(7.41%)、1种酮类化合物(0.74%)。其中，萜烯类化合物总相对含量最多为40.23%。油菜花朵中挥发性物质的主体成分有8氢化-4-甲基-1H-环丙烯(16.08%)、石竹烯(8.67%)、十四烷(7.49%)等；次要成分有三十一碳烷(2.59%)、α-法尼烯(2.42%)等；修饰成分有5,9,13-三甲基-肉豆蔻酸甲酯(0.92%)、6,10,14-三甲基-2-十五烷酮(0.74%)等(表3、图4)。

2.4.5不同植物花朵挥发性物质比较

挥发性物质检测结果显示，4种植物花朵中挥发性物质的种类、含量存在相似性和差异性。

黄梨和砀山酥梨花朵所含的挥发性物质种类完全相同(21种)，但含量不同，如6,10,14-三甲基-2-十五烷酮，在黄梨中相对含量为20.84%，在砀山酥梨中为6.4%(表3、图4、图5)。

黄梨、砀山酥梨、巴梨和油菜花朵中均被检测到的挥发性物质有一种：2-羟基-戊酸甲酯(0.61%、1.89%、2.96%、6.03%)。除2-羟基-戊酸甲酯外，黄梨、砀山酥梨和巴梨花朵共有的挥发性物质有2种：罗勒烯(6.57%、2.28%、6.51%)、4-羟基丁基丙烯酸酯(1.31%、0.57%、1.71%)；黄梨、砀山酥梨和油菜花朵共有的挥发性物质有13种：D-柠檬烯酸、萘、2-甲基萘、2,4-二异氰酸基-1-甲基苯、2-甲基-3-羟基-2,4,4-三甲基丙酸甲酯、十四烷、2,6,10,14-四甲基-十六烷、十五烷、十六烷、三十一碳烷、2,6,10,14-四甲基-十五烷、6,10,1-三甲基-2-十五烷酮、5,9,13-三甲基-肉豆蔻酸甲酯；油菜和巴梨花朵的挥发性物质检测中未发现相同成分(表3、图4、图5)。

图4 梨树和油菜花朵挥发性物质占比分析Fig.4 Proportion analysis of volatile compounds in flowers of pears and rape

图5 梨树和油菜花朵的挥发性物质Fig.5 Volatile compounds in flowers of pears and rape

仅在黄梨和砀山酥梨花朵中检出的挥发性物质为5-十八烯、3,7,11,15-四甲基-1,6,10,14-十六碳四烯-3-醇、二十一烷、5-甲酰-2,4-二甲基-吡咯-3-腈、4,8,12-三甲基-3-十三碳烯腈；仅在油菜花朵中检出的挥发性物质为8氢化-4甲基-1H-环丙烯、石竹烯、1-甲基-5-甲酰-8(1-甲基乙基)-1,6-环丁二烯、α-法尼烯、γ-阿珠莫林、α-阿珠莫林、Δ-杜松烯；仅在巴梨花朵中检出的挥发性物质有(E,E,E)-3,7,11,15-四甲基己二酸-1,3,6,10,14-五烯(34.35%)、2-丁基辛醇(13.71%)、3 -甲基-1-丁醇(6.22%)等(表3)。

表3 梨树和油菜花朵挥发性物质及相对含量(%)Table 3 Volatile compounds and relative content in flowers of pears and rape

3 结论与讨论

3.1 影响访花偏爱性的因素

蜜蜂访花时，出现偏爱某种花朵的现象，称为“访花偏爱性”。蜜蜂较偏爱胜利油菜的气味，花朵气味可显著影响蜜蜂访花行为(官昭瑛等,2005)；施海燕等发现小蜂熊蜂Bombusspp.偏爱访问大花瓣的、草莓味的紫色花朵(施海燕等,2008)。

蜜蜂对不同品种的梨树及同花期植物油菜的访花偏爱性试验，结果显示油菜的访花蜜蜂数量和访花频率显著高于砀山酥梨；3种不同的梨花中，巴梨的访花蜜蜂数量和访花频率高于黄梨和砀山酥梨。这个结果验证了前人的看法：蜜蜂有访花偏爱性；当梨树周围存在同花期植物如油菜时，蜜蜂对梨花的访花积极性会下降，更偏爱采集竞争植物油菜(付宝春等,2018)。试验中，7 ∶00-8 ∶00时间段内出现砀山酥梨的蜜蜂探访数量多于油菜的现象，导致这一现象的原因可能与蜜蜂喜欢先采集蜂箱周围植物，后再采集报酬较高的植物(Gegearetal.,2001)，而油菜地距蜂箱较远。

3.2 花蜜糖含量

花蜜中主要是含葡萄糖、果糖和蔗糖。花蜜糖含量及组分是蜜蜂访花偏爱性的一个影响因素。液相色谱示差折光检测法检测花蜜糖含量时，3种梨中，砀山酥梨花蜜的总糖含量及葡萄糖、果糖、蔗糖的含量均为最高，3种糖中，蔗糖含量最少；巴梨花蜜的蔗糖含量最少仅为0.001 g/mL。巴梨花蜜的总糖含量、蔗糖含量显著少于砀山酥梨，蜜蜂访花偏爱性试验中，蜜蜂更偏爱采集巴梨，可能蜜蜂偏爱采集蔗糖含量少的花朵有关。

迟韵阳等(2020)研究表明，油菜花蜜的葡萄糖、果糖、蔗糖含量分别为11.16 g/100 g、11.68 g/100 g、1.20 g/100 g，总糖含量为24.04 g/100 g；而范新涛等(2014)的研究中，油菜花蜜的葡萄糖、果糖、蔗糖含量分别为180.9 mg/mL、160.9 mg/mL、0 mg/mL，总糖含量341.8 mg/mL；韩月鑫等(2019)检测表明，油菜花蜜的葡萄糖、果糖、蔗糖含量分别为51.2±0.4 mg/mL、61.6±0.4 mg/mL、0.03±0.02 mg/mL，海藻糖含量0.48±0.03mg/mL，总糖含量115.4±0.6 mg/mL。上述研究均表明了油菜总糖含量高于3种梨花的总糖含量(8.274±0.038mg/mL、7.229±0.015 mg/mL、5.344±0.042 mg/mL)。访花偏爱性试验中，蜜蜂更喜欢访问油菜，表明蜜蜂更爱采集花蜜含糖量高的花朵(董霞,2009)。

蜜蜂的访花偏爱性不仅受到花蜜糖类和浓度影响，还受到花粉花香等其它因素的影响。

3.3 花粉氨基酸组分及含量

3种梨花花粉及油菜花粉的氨基酸组分和含量显示，巴梨花粉中的Cys高于砀山酥梨和黄梨、Lys低于砀山酥梨和黄梨；砀c山酥梨Arg高于油菜。结合蜜蜂访花偏爱性试验，蜜蜂的采集偏爱性可能与花粉中的高含量的Cys和低含量的Lys、Arg有关。

3.4 花朵挥发性物质

植物开花时，花朵的挥发性物质可以对传粉昆虫的行为产生影响，可以吸引或者趋避传粉昆虫。

萜烯类挥发性化合物具有很强的香味，是最大的一类天然植物产物，在调节生物间的有益作用和拮抗作用方面具有不同的功能，萜烯类化合物是吸引传粉者(动物、昆虫、哺乳动物、鸟类和蝙蝠)的主要因素(龙登隆,2019)。黄梨、砀山酥梨、巴梨和油菜的花朵挥发物中萜烯类物质的含量分别为14.76%、19.02%、40.86%和44.23%；其中油菜花朵的挥发性物质总相对含量、相对含量最多均为萜烯类化合物。这可能是蜜蜂偏爱采集油菜的的原因之一。有研究发现蜜蜂对α-法呢烯、柠檬烯等化合物敏感(Granero MAetal.,2005;Theis,2006;Doetterletal.,2010)。4种植物花朵中，只有油菜花朵挥发物中含有α-法呢烯(2.42%)；同时柠檬烯可在黄梨、酥梨和油菜的花朵挥发物中被检测到(2.42%、4.60%、6.58%)，其中在油菜相对含量最高。α-法呢烯、柠檬烯可能导致了蜜蜂的访花偏爱性。在对牧草盲蝽Lyguspratensis触角电位测试中发现，对芳樟醇等成分反应明显(Williamsetal.,2010)。茶树花Camelliasinensis、茶树鲜叶的α-法呢烯、芳樟醇、石竹烯对中华蜜蜂有显著引诱作用(蒋世雄等,2019)。3种梨花中，巴梨挥发性物质中含有芳樟醇(4.43%)，猜测芳樟醇的存在可能是巴梨的访花蜜蜂数量、访花频率高于砀山酥梨的原因之一。石竹烯单独和加入性诱剂中均表现对黏虫的引诱作用(吴国火等，2020)。4种植物的花朵挥发性物质检测，只在油菜中检测到石竹烯相对含量为8.67%，可能对蜜蜂产生引诱作用。

本研究通过开展蜜蜂访花偏爱性试验，表明蜜蜂对不同品种梨树和同花期竞争植物油菜的访花偏爱性有差异，油菜的存在会导致蜜蜂对梨花的访花积极性下降；通过检测不同品种梨树和同花期竞争植物的花蜜含糖量、花粉中氨基酸含量和组分、挥发性物质，结合本研究的蜜蜂访花偏爱性试验，蜜蜂偏爱采集巴梨，表明蜜蜂可能更爱探访花蜜中蔗糖含量低或花粉中Cys含量高或Lys含量低的植物；蜜蜂喜欢探访油菜，可能与油菜花粉中的Arg含量低有关；蜜蜂不偏爱采集砀山酥梨可能与萜烯类、柠檬烯、芳樟醇、石竹烯等物质在挥发性物质中的相对含量影响到访花偏爱性，当周围存在蜜蜂偏爱采集的植物时，降低了对砀山酥梨的访花积极性。这将为下一步利用花朵特征诱导蜜蜂为梨树授粉提供理论参考。