影响‘41B’葡萄体细胞胚诱导因素的研究

张凯，袁昀章，常欣玉，马靖，刘慧，陈文婷，谭君，杨国顺，白描*

（湖南农业大学园艺学院，湖南长沙 410128）

葡萄中体细胞胚（somatic embryo，SE）的诱导是最适宜的转基因途径之一[1]，也是诱导体细胞无性系变异的重要策略。体细胞胚可超低温保存，用于研究胚胎发育以及获得无病毒植株[2-4]。体细胞胚发生包括胚性细胞（embryonic cell，EC）的获得、体细胞胚的诱导（somatic embryo induction，SEI）和胚性细胞的维持（embryonic cells maintenance，ECM）等过程。Mullins等[5]于1976年首次报道了‘赤霞珠’采用液体培养进行体细胞胚发生再生植株的方法。Krul等[6]在固体琼脂培养基条件下，从杂交葡萄‘Seyval’的愈伤组织中获得了体细胞胚。随后，其他品种也被证明能够诱导产生胚性细胞，不同的外植体如叶片、花药、合子胚、子房和种子等被用于胚性细胞的获得，并进行体细胞胚的诱导[1,7-8]。在液体培养基中，可以获得大量体细胞胚，但大多数胚胎表现异常，很难恢复为正常的植株[9-10]。

在葡萄属植物中，未成熟的花药是应用最广泛的外植体，子房和全花也被证明适合体细胞胚发生，而其他外植体很少被使用[11-12]。近年来已经发布了一些体细胞胚发生的方案，其中‘41B’葡萄是早期发现具有很强再生能力的品种。‘41B’为欧美杂交种（Vitis viniferaChasselas×Vitis berlandieri），用其花药可培养出二倍体细胞。该细胞在悬浮培养中容易形成均匀的细胞团，扩繁培养方便，同时显示出良好的产生球形和心形胚胎的能力。但随后胚胎的进一步发育受阻，大部分成为畸形苗，只有少数能发育成正常苗[13]。

为明确‘41B’细胞再生能力的发生条件和作用机理，为其他品种的体细胞胚发生提供参考。本研究比较了不同物质或处理对‘41B’细胞的体细胞胚诱导的影响，对处理后体细胞诱导效率和同步性等进行了检测，研究结果可加深对限制葡萄体细胞发生因素的认识，也可为葡萄体细胞胚诱导相关研究试验处理的设置提供依据。

1 材料和方法

1.1 研究材料

‘41B’胚性细胞分离自其花药，来自中科院北京植物园代占武实验室。GM固体基本培养基（GMS）配方和配制方法参考文献[14]，所用试剂均购自Sigma或索莱宝等公司。其中，植物琼脂（P1001）、1/2MS大量购自Duchefa；反式玉米素核苷（ZR，Z3541）、6-苄基腺嘌呤（6-BA，B3408）、噻苯隆（TDZ，P6186）、甘油（G5516）、生物素（B4639）、烟酸（N0761）、硫胺素（T4625）、盐酸吡哆醇（P9755）、肌醇（I7508）均购买自Sigma。活性炭（activated charcoal，AC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D，D8100）、萘氧乙酸（NOA，B8400）、透析膜（dialysis membranes，DM，Y1071）、脱落酸（ABA，A8060）、丁酸钠（NaB，IS0190）、麦芽糖（D8110）和蔗糖均购自索莱宝公司。

1.2 研究方法

‘41B’胚性细胞的维持和扩繁采用GMS+1 mg·L-1NOA（pH=6.8）培养基，置于25 ℃培养箱，黑暗条件下培养。体细胞胚诱导培养条件：将细胞置于25 ℃，光强4000 Lux的培养箱中，光周期为16 h/8 h（光照/黑暗）。

‘41B’细胞在GMS基础培养基上进行体细胞胚诱导。GMS基础培养基为：1/2MS＋微量（0.05 mg·L-1生物素＋0.5 mg·L-1硫胺素＋5 mg·L-1烟酸＋0.5 mg·L-1盐酸吡哆醇＋100 mg·L-1肌醇）＋4.6 g·L-1甘油＋18 g·L-1麦芽糖＋7 g·L-1琼脂。以GMS为基本培养基，在其基础上进行设置（表1），化合物浓度（标注）如下：1 g·L-1PVP（P1）；3 g·L-1（AC3）或6 g·L-1（AC6）活性炭；1 mg·L-1或2 mg·L-1的三种不同类型的细胞分裂素（分别标注为ZR1、ZR2；TDZ1、TDZ2；6-BA1、6-BA2）；透析膜（DM）；0.05 g·L-1（NaB0.05）和0.5g·L-1（NaB0.5）的丁酸钠；0.1 mg·L-1（ABA0.1）或1 mg·L-1（ABA1）脱落酸；添加20 g·L-1蔗糖（S20）或将甘油和麦芽糖替换为20 g·L-1（GMS(-G/M)＋S20）或60 g·L-1（GMS(-G/M)＋S60）蔗糖。

表1 所采用的培养基Table 1 Media used in this study

在超净工作台上，接种‘41B’细胞。接种量为每个平板（9 cm×2 cm）接种100 µL细胞（在1 g离心率下沉降），用勺子摊平，直径约为5 cm。接种细胞后，每天用体视显微镜（OLYMPUS，SZX7）进行观察，并记录生长状态。不同类型的细胞状态不同：‘41B’胚性细胞整体上呈黄色疏散状，非胚性细胞/愈伤呈现白色透明松软状，体细胞胚（球形胚）呈现白色致密球状。

由于原接种细胞和形成球形胚的数目很难定量，为表征SEI速度和同步性，将形成球形胚占接种细胞面积的百分比来进行观察统计。每天观察记录，重复3次。文中FD：表示开始发现有球形胚时所经历的天数；FD＞10%：表示当细胞中球形胚达到总体细胞团面积的10%左右时所经历的天数；FD＞50%：表示当细胞中球形胚达到总体细胞团面积的50%左右时所经历的天数；RSE/30 d：指培养30 d后球形胚占胚性细胞总体细胞团面积的比率。同时对‘41B’细胞褐化程度进行排序：0代表该细胞状态良好，所有细胞呈现淡黄色，几乎没有褐化；1代表细胞有褐化出现；5代表有一定程度（0～10%）褐化；7代表中度（10.01%～15%）褐化和9代表出现严重（＞25%）褐化。

2 结果与分析

2.1 葡萄体细胞胚形成的各个阶段

‘41B’体细胞胚诱导过程中不同阶段细胞状态如图1所示。‘41B’葡萄胚性细胞维持在培养基M1（GMS＋P1＋NOA1）中（图1A）。在转入培养基T1（GMS）后，体细胞胚诱导经历了球形胚（图1B）、心形胚、鱼雷胚和子叶胚（图1C）以及胚萌发和成苗过程。球形胚为白色致密球状；体细胞胚发育速度不一致，心形胚、鱼雷胚和子叶胚可能同时出现（图1D）。而在T1培养基上，几乎所有体细胞胚萌发后都为畸形（图1E和1F）。

2.2 活性炭和生长素对胚性细胞维持的影响

本研究对影响胚性细胞维持的条件进行了调查，在不同培养基上暗培养30 d后，结果发现：（1）活性炭（AC）除了显著抑制褐化外，其非选择性吸附作用对激素浓度的影响显著。胚性细胞（EC）可以在含生长素的培养基中维持（M2：GMS＋P1＋NOA1或M4：GMS＋P1＋2,4-D1）；但当有3 g·L-1AC存在时，即使含有NOA（1 mg·L-1或4 mg·L-1），EC也极易诱导为SE；而1 mg·L-12,4-D对胚性细胞维持的作用不能被AC抑制（图2A）。（2）胚性细胞维持过程中不同生长素对后续体细胞胚的诱导影响不同。相对于NOA，2,4-D处理会抑制后续成胚能力（图2B），这可能与2,4-D在细胞中稳定而难以去除有关。

2.3 不同化合物对‘41B’体细胞胚诱导的影响

在不同处理后，每天记录各个处理球形胚所占的比例和褐化状态，持续观察30 d，统计结果如表2。

2.3.1 活性炭和PVP对葡萄体细胞胚诱导的影响

‘41B’细胞在T1培养基（GMS）中，细胞褐化较严重（图3A）；在添加PVP（T2）后对减轻细胞褐化有一定程度的改善，但不明显（图3B）；而添加3 g·L-1（T3）和6 g·L-1（T4）AC，细胞生长状态良好，几乎无褐化现象，且相对T2发育速度加快（图3C和3D）。AC对SEI速度有一定程度的提高（表2）：T2（GMS＋P1）和T3（GMS＋P1＋AC3）处理第12天左右开始成胚，分别培育18 d和21 d后成胚比例达到50%（表2），而T4（GMS+P1+AC6）处理第8天开始成胚，18 d后成胚比例达到50%。

表2 不同化合物或处理对葡萄体细胞胚诱导的影响Table 2 Effects of different compounds or treatments on grape somatic embryo induction

2.3.2 细胞分裂素对葡萄体细胞胚诱导的影响

‘41B’胚性细胞在含有1 mg·L-1或2 mg·L-1三种不同类型的细胞分裂素的培养基中培养发现，细胞分裂素显著抑制了SEI，且不同类型细胞分裂素具有一定差异（图3E-J）。ZR对SEI的抑制作用相对弱于6-BA和TDZ。两个浓度下6-BA和TDZ以及2 mg·L-1的ZR显著促进非胚性愈伤的形成。

2.3.3 丁酸钠对葡萄体细胞胚诱导的影响

低浓度NaB（0.05 g·L-1）的处理加速了SE的形成，但对体细胞胚比例无明显影响（图3K，表2）。高浓度NaB（0.5 g·L-1）对细胞具有杀伤作用，致使‘41B’细胞死亡（图3L）。另外，还尝试了在NaB（0.5 g·L-1）基础上添加AC（3 g·L-1），发现NaB没有完全致死细胞，但促进了非胚性细胞的增殖，进而抑制SEI。

2.3.4 透析膜对葡萄体细胞胚诱导的影响

将细胞置于透析膜（DM）上（T11：GMS＋P1＋DM）进行培养，结果发现，体细胞胚出现速度加快，在第8天就有出现；但是在培养10 d后，开始干燥泛白、褐化严重，后期体细胞胚无法正常发育（表2，图3M）；DM外和DM上的胚性细胞有明显的区别，DM外或其边缘胚性细胞通过对培养基上营养和水分的吸收，在21 d后开始出现体细胞胚，且部分体细胞胚提前萌发（图3N），而在DM上的细胞出现脱水现象，这可能与透析膜两边，细胞和培养基之间的渗透压差太大有关。

2.3.5 ABA对葡萄体细胞胚诱导的影响

本研究调查了ABA对SEI的影响。发现随着浓度提高，ABA对SEI的抑制作用加剧，0.1 mg·L-1和1 mg·L-1ABA可显著抑制体细胞胚的形成，且抑制后续的萌发（图3O和3P）；但当有3 g·L-1AC存在时，1 mg·L-1ABA却加速了部分体细胞胚的萌发（图3Q）。由于不能确定AC浓度与吸附效率的关系，加上其吸附作用可能没有选择性，因此很难判断ABA的有效浓度。与未加ABA的对照（T2，图3B）比较，低浓度的ABA可能促进体细胞胚的萌发。

2.3.6 不同碳源及浓度对葡萄体细胞胚诱导的影响

GMS中碳源为麦芽糖和甘油，本研究以20 g·L-1蔗糖替换该碳源（T17：GMS(-G/M)＋S20＋P1），结果发现SEI起始没有明显加快，但后期速度加快，体细胞胚出现更加同步；不过有部分体细胞胚发育加快，且有明显的褐化（表2，图3R）。在T17基础上添加AC后（T18），形成体细胞胚速度减慢，体细胞胚形成的同步性变差，且伴随部分非胚性细胞的增殖（表2，图3S）；而当蔗糖提高到60 g·L-1，SEI速度加快，且体细胞胚形成的同步性显著提高，SE呈乳白色，后续观察发现萌发速度显著减慢（表2，图3T）。

3 讨论与结论

在SEI过程中，各种培养条件和化合物的使用被提及。首先，生长素被证明是胚性细胞维持的关键，而外源生长素去除是SEI的关键。在高浓度的生长素处理下，一些特定的细胞有机会获得再生能力，随后降低生长素浓度有利于胚性细胞诱导为体细胞胚[15-16]。‘41B’主要使用NOA进行胚性细胞的维持，而我们使用2,4-D进行比较发现，2,4-D处理会使细胞（团）形态发生变化，后续成胚能力受到严重抑制，这可能与2,4-D稳定不易迁移难以去除有关，也可能与不同类型生长素的作用机制差异有关。

在SEI过程中细胞褐化的抑制很重要。添加PVP和AC是细胞培养中防止褐化的重要手段[17]。但本研究发现，PVP对于‘41B’细胞褐化抑制效果并不明显，而AC效果显著。另外，AC也显著提高了SEI的速度和一致性，暗示AC可能吸附了一些抑制SEI的物质。在SEI过程中，众多研究都有添加AC的习惯，反而导致AC对SEI的关键作用被忽略[13,18]。本研究再次强调了AC在SEI中的重要性，同时需要注意由于AC的非选择性吸附，培养基中激素等添加物的有效浓度可能与无AC添加的培养基不同，其具体影响程度需要进一步研究。

前人研究发现，添加细胞分裂素有利于细胞再生[19]，甲基化的去除可调控众多再生相关的基因。研究显示，采用组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂NaB，对葡萄体细胞胚形成具有积极作用[20]。另外，水分的有效性对诱导体细胞胚很关键。体细胞胚的成熟与其储备产物的积累和干燥度有关。研究发现，透析膜的使用可以减少水分的可用性，显著提高柑橘和葡萄等体细胞胚的诱导率[21]；高浓度蔗糖和ABA的使用也可能调节水分的利用，从而促进体细胞胚的形成，而且ABA被证明能减轻体细胞胚的畸形率[22]。

在本研究中发现，不同类型细胞分裂素都对‘41B’细胞的再生没有积极作用，还会促进非胚性细胞的增殖。这提示，由基因型决定的具有高再生能力的葡萄类型或品种，无需细胞分裂素进行体细胞胚诱导。这可能与内源细胞分裂素浓度有关，但具体原因还有待证实。本研究发现，低浓度NaB可能促进体细胞胚的形成，但高浓度NaB可使细胞白化死亡。这暗示对组蛋白去乙酰化酶的强烈抑制，可能对细胞造成不可逆的损伤，在对其他种类或品种葡萄使用时应注意其浓度。另外，‘41B’葡萄的SE萌发后几乎都是畸形。这与前人研究结果不同[22]，ABA对降低‘41B’葡萄SE的畸形率没有明显作用。

在SEI过程中，高浓度ABA抑制体细胞胚的形成和萌发，但在AC存在情况下，低浓度ABA则可能促进体细胞胚的萌发。AC对各类化合物可能具有非选择性吸附，从而降低其有效利用率，这对试验结果造成不可预测的影响，需引起重视。

最后，本研究发现，水分的利用对体细胞胚的形成影响显著，DM或高浓度的蔗糖都可能影响了水分的利用。但是，持续处于DM上的细胞容易过度失水，进而影响体细胞胚的发育；而高浓度的蔗糖可提高体细胞胚的诱导效率和其生长的同步性。综上，活性炭和蔗糖的利用有利于葡萄体细胞胚的诱导，具有进一步深入研究的价值。