烟台地区3785例新生儿遗传性耳聋基因位点筛查分析

张彦红 高凌云 李颖斌 马莉 刘日明

耳聋是我国常见的出生缺陷之一，给患者带来了巨大的痛苦和生活不便。我国耳聋在新生儿中的发病率为1‰～3.47‰，遗传因素致聋比例高达50%～60%[1]。目前，遗传性耳聋相关基因很多，我国人群中耳聋基因的突变70%来源于GJB2、GJB3、SLC26A4和mt DNA 12S rRNA[2～6]。为了解烟台地区新生儿耳聋基因的突变情况，本研究采用微阵列基因芯片方法筛查，并联合Sanger测序进行验证，探讨耳聋基因筛查在预防新生儿遗传性耳聋发生的意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2017年11月1日～2021年6月30日烟台毓璜顶医院正常分娩的3785例新生儿作为研究对象，该研究经院伦理委员会批准，监护人接受新生儿遗传性耳聋基因检测，并签署知情同意书。按照《新生儿疾病筛查技术规范（2010 版）》和采血常规要求[7]，采取新生儿足跟血制备滤纸干血斑，4 ℃保存备用。

1.2 仪器与试剂

采用15项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒（微阵列芯片法）（北京博奥晶典生物技术有限公司，国械注准20173401343）。芯片洗干仪（北京博奥晶典生物技术有限公司，晶芯SlideWasher 24），微阵列芯片扫描仪（北京博奥晶典生物技术有限公司，晶芯LuxScan 10K-B）。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 采用打孔器取1个直径6 mm干血斑标本，采用滤纸干血斑核酸提取试剂盒进行基因组DNA提取。

1.3.2 PCR扩增 按照被检样品数的3倍准备200 µl八联排管，并在管上标记样品编号，3套管一一对应。将融化后混匀的PCR扩增试剂A、B、C按20 µl/管分别装到3个PCR扩增管中。向A、B、C3管扩增试剂中分别加入5 µl样品基因组DNA，作为PCR扩增的模板，每份PCR反应体系总体积为25 µl，在ABI 9700上进行扩增，扩增条件：阶段1：活化37℃ 10 min，95℃ 15 min；阶段2：35个循环（95℃30 s；变温速度 0.4 ℃/s；57 ℃ 30 s；变温速度0.2 ℃/s；70℃ 45 s）；降温60 ℃ 10 min，12 ℃ 1 h。

1.3.3 芯片检测 将PCR产物纯化、杂交、芯片洗涤干燥（开启芯片洗干仪，设置参数：洗涤Ⅰ，42 ℃，洗涤1次，2 min，力度3；洗涤Ⅱ，42 ℃，洗涤2次，每次1 min，力度3）、使用晶芯®LuxScan™10K-B微阵列芯片扫描仪和晶芯®15项遗传性耳聋基因检测分析系统（微阵列芯片法）进行信号读取及判断和结果判读检测结果由晶芯®十五项遗传性耳聋基因检测分析系统（微阵列芯片法）自动判读。

1.3.4 结果验证 对基因芯片检测出现突变位点的样本使用一代测序法（Sanger测序法）进行验证。

1.4 统计学分析

采用SPSS 23.0软件对数据进行分析。组间比较采用Pearson和似然比卡方检验，两两比较采用Bonferroni法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耳聋基因突变在性别中的分布情况

3785例新生儿遗传性耳聋基因检测，总共检出255例突变，总突变率为6.74%。3785例新生儿包括2135例男孩和1650例女孩，其突变携带率分别为6.93%（148/2135）和6.48%（107/1650），男孩略高于女孩，但无显著差异（χ2=0.296，P=0.586）。

2.2 耳聋基因单基因突变检测情况

3785例新生儿中，单基因杂合突变242例，突变率6.39%。其中GJB2突变携带者134例，携带率3.55%（134/3785）；SLC26A4突变携带者85例，携带率2.25%（85/3785）；GJB3突变携带者12例，携带率0.32%（12/3785）；线粒体耳聋基因相关突变携带者11例，携带率0.29%（11/3785），其中8例1555 A＞G同质突变和3例1555 A＞G异质突变。对于烟台地区新生儿耳聋基因单基因突变，GJB2突变率最高，其次是SLC26A4，GJB3和mt DNA 12S rRNA突变率最低，见表1。

表1 3785例新生儿耳聋基因单基因突变位点筛查结果

2.3 耳聋基因多位点突变检测情况

3785例新生儿中，有13例耳聋基因双位点突变，突变率0.34%（13/3785）。其中，6例非等位基因复合杂合突变（1例c.235delC/c.538 C＞T、2例c.299_300delAT/IVS 7-2 A＞G、1例c.299_300delAT/c .2168 A＞G、1例c.235delC/IVS15+5 G＞A和1例c.235delC/IVS 7-2 A＞G），5例等位基因复合杂合突变（1例c.235delC/c.299_300delAT、3例c.2168 A＞G/IVS 7-2 A＞G和1例c.2168 A＞G/C.1975G＞C），2例核基因与线粒体基因复合变异（2例c.235delC/m.1555 A＞G），见表2。

表2 3785例新生儿耳聋基因双位点突变筛查结果

2.4 与山东省耳聋基因突变情况比较

为了解烟台地区新生儿耳聋基因在山东省的突变情况，本研究汇总山东省各地区（烟台、东营、济宁、淄博、济南、威海）近5年新生儿耳聋基因的情况[6，8～11]。山东省各地区累计检测102903例新生儿，共检出耳聋基因 突变携带者5703例，总突变率5.54%，分别检出2781例GJB2、2143例SLC26A4、414例GJB3、303例mtDNA 12S rRNA和62例多位点复合变异，其突变率分别是2.70%、2.08%、0.40%、0.29%和0.06%。对于新生儿耳聋基因总突变率和GJB2突变率，烟台地区（6.74%，3.55%）显著高于山东省平均突变情况(5.54%，2.70%；χ2=32.20，P＜0.001)；而SLC26A4、GJB3和mtDNA 12S rRNA基因突变率烟台地区与山东省平均突变情况相比无显著性差异（P＞0.05）。针对相同的检测方法（微阵列芯片检测法）和筛查位点（4个基因15个位点），烟台地区耳聋基因突变率与淄博地区比较，有显著差异（χ2=81.22，P＜0.001）。对于新生儿耳聋基因总突变率，烟台地区（6.74%）明显高于淄博地区（5.20%）(P＜0.05)。对于GJB2基因突变率，烟台地区(3.55%)与淄博地区（2.63%）相比，有显著差异(P＜0.05)。对于SLC26A4、GJB3和mtDNA 12S rRNA基因突变率，烟台地区与淄博地区相比，均无显著性差异（P＞0.05）。总体而言，对于新生儿耳聋基因总突变率和GJB2基因突变率，烟台地区明显高于山东省平均突变率；对于SLC26A4、GJB3和mtDNA 12S rRNA基因突变率，与山东省平均突变率相比无差异(P＞0.05)，见表3。

表3 山东省各地区耳聋基因突变情况汇总[%（n）]

3 讨论

耳聋是一种常见的感觉障碍性疾病，遗传、环境因素或两者共同作用，60%以上与遗传因素有关[1]。遗传性耳聋基因很多，截止目前耳聋基因至少有121个[2]，其变异位点和遗传模式存在高度异质性，导致病因诊断的困难。因此，开展新生儿耳聋基因筛查，可早诊断、早治疗，有效干预耳聋的发生，尤其是母系遗传的药物性耳聋基因和迟发型耳聋基因所致。

GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体mt DNA 12S rRNA是遗传性耳聋常见的致病基因[2，12]。本研究利用微阵列芯片法检测4个基因15个位点，发现3785新生儿中有255例耳聋基因突变，突变率为6.74%，高于山东省耳聋基因平均突变情况（5.54%），也高于淄博地区报道的4个基因15个位点的耳聋突变率（5.20%）[9]。总体上，烟台地区新生儿耳聋基因的突变率高于山东省平均突变率，为烟台地区新生儿预防遗传性耳聋有一定指导意义。

我国人群中，GJB2基因是最常见的非综合征型遗传性耳聋突变基因，该基因位于13q11～q12，编码缝隙连接蛋白26，属于常染色体隐性遗传[13]。GJB2基因突变导致听力损失的个体化差异较大，但大部分患者可通过植入人工耳蜗改善听力。本研究，烟台地区GJB2基因突变率（3.55%），明显高于淄博地区（2.63%）该基因的突变率[9]，也高于山东省平均突变率水平（2.70%），也高于国内人群流调GJB2基因突变率（2.42%）[1]。其中，以c.235delC检出率最高，而c.35delG位点在本研究中仅检测出1例。同时，还检出6例非等位基因复合杂合突变、2例核基因与线粒体复合突变和1例等位基因复合杂合突变。

SLC26A4基因位于7q31，含21个外显子，编码穿膜蛋白Pendrin，属于常染色体隐性遗传，其突变会导致先天性或迟发性耳聋，通常伴有前庭水管扩大[14]。本研究筛查发现85例SLC26A4单基因杂合突变（2.25%），与山东省平均突变率（2.08%）无显著差异；与淄博地区（1.88%）相比无显著差异[9]。其中，烟台地区IVS 7-2 A＞G位点检出率（1.32%）最高，这与国内流调检出率（1.34%）相一致[1]，而c.1229 C＞T位点仅检出1例。同时，检出4例SLC26A4等位基因复合杂合突变（3例c.2168 A＞G/IVS 7-2 A＞G和1例c.2168 A＞G/C.1975G＞C）。

GJB3基因位于1p33～35，编码缝隙连接蛋白31，该基因突变可导致高频听力损失或后天性耳聋[15]。携带GJB3基因c.538C＞T位点杂合突变的35例携带者（年龄23～37岁）听力正常[16]。本研究发现12例携带GJB3基因c.538C＞T位点杂合的新生儿（0.32%），与山东省该基因的平均突变率（0.40%）相比无显著性差异（P＞0.05），与淄博地区报道相一致[9]。遗传性耳聋基因筛查规范认为，如果携带该基因变异者通过新生儿听力初筛，建议进入常规儿童保健流程，除非有听力下降的表现，否则不需要进行定期听力检查[1]。因此，携带GJB3基因的新生儿听力正常，可以不需要定期监测听力情况；若未通过，则需要进一步行诊断性听力检查，以明确耳聋的病因。

线粒体耳聋相关基因变异（均质性变异或异质性变异）受检者及母系家族成员均为药物敏感个体，应终生慎用氨基糖苷类抗生素，以避免药物性耳聋的发生[17]。目前线粒体耳聋相关基因研究最多位点是mtDNA12S rRNA的mt.1555A＞G和mt.1494C＞T位点。本研究共检出13例线粒体相关耳聋基因突变，均是mt.1555A＞G位点的突变，mt.1494C＞T位点未检出。本研究mtDNA12S rRNA基因突变率（0.29%），与山东省该基因平均突变率（0.29%）相一致，与淄博地区报道的突变率也无统计学上的差异[9]。其中包括11例线粒体突变（8例均质性突变和3例异质性突变）和2例核基因与线粒体复合突变。对于线粒体耳聋相关基因突变的患者，避免使用氨基糖苷类抗生素，以防止药物性耳聋的发生。

综上所述，本研究通过对烟台地区3785例新生儿进行耳聋基因筛查，初步确定烟台地区常见遗传性耳聋基因的突变类型和突变率。发现烟台地区耳聋基因总突变率明显高于山东省平均突变率，尤其是GJB2基因的突变率要高于山东省其他地区，将考虑扩大研究新生儿的数量，结合听力筛查，明确烟台地区新生儿的耳聋情况。及时干预和治疗，有效预防和减少耳聋的发生。