PLA2R-IgG间接荧光定量免疫层析分析的构建与应用*

张艺 周颖 周衍 马骐 叶燕 殷皓 俞蕾 周彬 王春新*

（1）江苏省原子医学研究所，国家卫生健康委员会核医学重点实验室，江苏省分子核医学重点实验室，无锡 214063；2）南京医科大学附属无锡人民医院医学检验科，无锡 214023；3）南京医科大学原子医学教学科研基地，南京 211166）

特发性膜性肾病（idiopathic membranous nephropathy，IMN）发病率在中国呈逐年上升趋势，其诊断的金标准为肾脏活检［1-2］。然而肾脏穿刺具有侵入性和复杂性，需要操作专业的医护才能开展，而且需要患者入院进行，这使得IMN的准确诊断受到了局限。Beck等［3-4］发现70%以上的IMN患者体内存在磷脂酶A2受体（phospholipase A2 receptor，PLA2R）的抗体IgG，随着研究深入，肾脏病权威组织“改善全球肾脏病预后组织（Kidney Disease Improving Global Outcomes，KDIGO）”制定了IMN的临床实践指南，提出血清PLA2R-IgG作为首要诊断依据，根据测定结果再考虑是否活检［5］，因此该指标的检测必要且关键。同时，PLA2R-IgG水平与IMN疾病进程和缓解相关，能够指导个性化用药，低浓度水平意味着可持续使用保守疗法［5-6］。因此，定量分析PLA2RIgG也是新方法必备的性能。目前临床主要采用酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）作为检测手段［7］。ELISA检测线性范围宽，适合批量测试，但不适合门诊患者随到随检。因此，研制单人份、快速且定量的PLA2RIgG检测方法十分必要。

本研究首次报道采用两步法进行PLA2R-IgG的间接免疫层析分析（immunochromatographic assay，ICA），令抗原抗体能在短小的试纸条上充分反应，在保证快速性的前提下，提高检测的特异性；使用镧系元素铕（Eu）作为发光物质，发挥该元素荧光信号强、背景低、抗干扰的特性，进而实现PLA2R-IgG抗体的快速、灵敏、定量检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

HG-98免疫层析定量分析仪为上海互帼公司产品，酶标仪为美国Bio-Rad公司生产，喷金划膜仪和切条机由杭州赛凯生物公司制造。带羧基的Eu荧光微球（Bangs Laboratories，美国），重组表达的PLA2R抗原（无锡傲锐东源），抗人IgG单抗（Hytest，芬兰）；羊抗鼠IgG抗体、样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、6 cm底板和卡壳购自杰一生物（中国）。N-羟基丁二酰亚胺（NHS），2-［N-吗啉］乙磺酸（MES），1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和牛血清白蛋白（BSA）购自Sigma-Aldrich（美国）。其他试剂均为国药沪试生产，纯度为分析纯。PLA2R-IgG抗体标准品和ELISA检测试剂盒为德国欧蒙医学实验诊断股份公司产品。

1.2 抗体偶联荧光微球的制备

将1 mg羧基微球溶解在500 μl的制备液（0.1 mol/L的MES溶液）中，先用超声仪分散，再离心15 000×g，时长20 min，将上清液小心地吸去，重复两次；之后，向微球中加入100 μl含有1 mg NHS和1 mg EDC的水溶液，用制备液补齐体积至500 μl，避光振荡反应0.5 h后，用该溶液洗涤微球3次；再将一定量的抗人IgG单抗加入至已活化的微球中，避光振荡2 h；然后，向反应液中加入10 μl含10% BSA的Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L，pH7.2），避光振荡0.5 h；用蒸馏水洗涤去除多余抗体，方法同前；最后，将偶联了抗人IgG单抗的微球复溶于含1%BSA和0.1%Tween-20的Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L，pH7.2）中，使其浓度为2.5 g/L。

1.3 试纸条的制备

PLA2R-IgG-ICA试纸条由样品垫、硝酸纤维素膜（NC膜）、吸水纸和6 cm底板构成，制备时，先把硝酸纤维素膜贴在背板中央，再把PLA2R抗原或羊抗鼠二抗分别喷涂在硝酸纤维素膜上，构成间隔5 mm的检测线（test line，T line）和质控线（control line，C line）。30℃烘干膜条2 h，以固定上述蛋白质。然后，将样品垫和吸水纸分别粘贴于上述硝酸纤维素膜两端，形成2 mm的重叠。最后，将切割成4 mm宽的免疫层析试纸条带装入单人份的塑料卡壳中，再放入铝膜袋长期保存。

1.4 检测步骤

将血清样本用稀释液（含有0.5%BSA的pH7.8 0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液）按适当比例稀释，滴加入速测卡加样孔内，37℃孵育。再加入由稀释液配制的抗人IgG单抗标记的Eu微球，37℃孵育适当时间。随后将速测卡插入HG-98免疫层析定量分析仪检测，仪器自动显示检测结果。反应过程示意见图1。

Fig.1 Reaction principle diagram of PLA2R-IgG-ICA

1.5 性能考核

参照现行国家标准［8］，对构建的PLA2R-IgGICA进行方法学考核。a.线性：检测PLA2R-IgG标准品0、10、20、100、500、1 500 RU/ml，各3次，对结果进行线性拟合并计算相关系数R；b.准确性：通过向两个低值样本等体积添加PLA2RIgG标准物质，每个添加样重复测定2次，实测值与理论值的比值为回收率；c.精密度：对浓度为19.8 RU/ml和102.7 RU/ml两个血样各重复测定10次，通过计算均值（Mean）和标准差（SD），获得变异系数（CV）；d.灵敏度：平行测定20次标准品稀释液，计算所测浓度的Mean+2×SD的值，此值即为灵敏度；e.特异性：检测高纯度的350 IU/ml抗过氧化物酶抗体和3 250 IU/ml抗甲状腺球蛋白抗体，若交叉反应率低于1%则认为特异性较好；f.加速稳定性：将37℃放置10 d与2～8℃保存的试剂同步检测标准品，计算各浓度点漂移率，若平均偏差小于15%，认为试剂稳定。

1.6 临床应用

IMN患者的血清样本采集由南京医科大学附属无锡人民医院提供，经医院伦理委员会批准，批准号：2020LLSL-ⅡYZ-08-01，收集时间是2020年10月～2021年4月。血样使用分离胶血清管采集，离心分离后分装保存于-40℃冰箱，检测前恢复至室温使用。方法比对的相关性用Passing-Bablok分析，相关系数R＞0.9且P＜0.05认为相关性好；阴阳一致性和其他参数的比较通过Pearson卡方检验统计分析，P＜0.05认为有显著性差异。

2 结 果

2.1 PLA2R-IgG免疫层析法的反应模式

本研究采用间接法检测，首先对反应步骤进行考察。传统的免疫层析法采用一步法检测，将样品与微球一起加在样品垫上，经毛细管层析作用与T线和C线的抗原、抗体反应。从图2a的1和2条带荧光照片可知，一步法荧光微球与样品在样品垫和NC膜交叠处产生蓄积，形成非特异条带。此外，从图2b的剂量曲线可知，一步法测量低浓度和高浓度标准品时曲线弯曲，影响线性范围。为解决此现象，本研究采用两步加样：先加入PLA2R-IgG标准品或稀释样品，令抗体与T线的PLA2R抗原反应，同时未反应的干扰物可被吸水纸吸附；再加入微球标记的抗人IgG抗体，经层析作用，于T线形成PLA2R抗原-人PLA2R IgG-微球抗人IgG抗体的复合物，过量的微球可被C线的羊抗鼠IgG捕获，未反应的试剂被吸水纸吸收。从图2可知，两步法比一步法降低了微球的非特异结合，且检测的线性范围更宽。

Fig.2 Comparison of PLA2R-IgG-ICA between one-step and two-step methods

2.2 检测方法的优化

为优化微球标记效率，本研究对微球制备液的pH和Eu微球-抗体反应比率进行选择，按照二步法反应，用标记的微球分别检测空白和高值标准品（1 500 RU/ml的PLA2R-IgG），每个浓度水平测量2次。用pH4.5、5.0和5.5的制备液标记的微球分别检测标准品（图3）。当制备液pH为5.0时，空白标准品的T/C（T线与C线荧光信号的比值）低，高浓度标准品T/C最高，所以采用pH5.0为制备液的最佳反应pH体系。

Fig.3 The effect of pH of MES buffer

为提高微球-抗体荧光信号，降低非特异吸附，对Eu微球和抗人IgG单抗的反应质量比按10∶1、25∶1、50∶1和100∶1进行筛选（图4）。当按照25∶1反应时，反应的高值标准品T/C高、空白标准品T/C较低，效果最佳，因此选择该条件制备微球。

Fig.4 The effect of the reactive ratio of Eu-microspheres vs anti-human IgG

为方便操作，令每步反应时间一致，然后考察了5、10和15 min/步对结果的影响（图5）。综合空白和高值标准品荧光计数的差异与时效，选择10 min/步为最适反应时间，即总孵育时间为20 min。

Fig.5 The effect of different reaction time

2.3 检测方法的性能指标

采用优化方案构建的PLA2R-IgG ICA灵敏度为0.7 RU/ml，标准曲线方程为y=0.771x-1.437，相关系数R=0.995，线性测量范围为0.7～1 500 RU/ml（图6）。向健康体检者血清样本中添加系列标准品，计算方法的添加回收率。由表1可知本方法回收率为86.27%～98.98%，在80%～120%范围内，判为方法准确。平行测定2例PLA2R-IgG浓度值分别为（18.91±1.94）RU/ml和（111.50±6.70）RU/ml的血样，平均批内CV为8.13%，小于15%，认为方法重复性好。用本方法分别检测350 IU/ml抗过氧化物酶抗体和3 250 IU/ml抗甲状腺球蛋白抗体，结果分别为0.6 RU/ml和0.3 RU/ml，交叉反应率均小于0.1%，认为新方法具有特异性。为考核按此方法制备试剂的稳定性，将已稀释微球溶液和试纸条置于37℃烘箱10 d，再检测标准品，与2～8℃保存的试剂相比，各浓度点偏移程度分别为：4.7%、14.7%、13.1%、0.4%和4.2%，平均值为7.4%，因此可知试剂存于37℃10 d稳定。

Fig.6 The standard curve of PLA2R-IgG ICA

Table 1 The recoveries of PLA2R-IgG ICA

2.4 临床应用

采用本方法与市售的ELISA试剂盒同步检测52例IMN患者的血清样本（图7），得到的相关性回归方程y=0.805x+0.373，R=0.953。R＞0.9且P＜0.01认为两种检测相关。本方法与ELISA试剂盒的正常参考值均为20 RU/ml，＜20 RU/ml判为阴性，否则为阳性。表2显示了两个方法的一致性比较和临床样本的一般信息，结果表明：IMN患者的性别与PLA2R-IgG水平有显著相关（P＜0.05），而是否老年患者、肾小球滤过率（eGFR，按CKD-EPI公式计算）异常程度与PLA2R-IgG水平无显著关系（P＞0.05），与市售ELISA试剂盒阴阳性判断一致（P＜0.05）。本方法对IMN的检出率为76.9%（40/52），与现有报导相符［3］。

Fig.7 The correlation of PLA2R-IgG-ICA and ELISA for detection IMN samples

Table 2 The results of PLA2R-IgG in serum samples of IMN patients with clinical parameters

3 讨 论

本研究构建了一种采用镧系元素为荧光剂的PLA2R-IgG-ICA，反 应 时 间20 min，灵 敏 度0.7 RU/ml，线性范围跨3个数量级，测量上限至1 500 RU/ml，且方程回归系数R＞0.990，对IMN的临床检出率达到76.9%，与国内外报道相符。而同类的ELISA试剂盒灵敏度0.6 RU/ml，线性范围6～1 500 RU/ml，回归系数R＞0.975，且需要1.25 h反应。综上，PLA2R-IgG-ICA性能指标与ELISA近似，能准确定量，且反应时间大幅减短。而ICA具有单人份特性，因此本检测方法在小样本量和随到随检方面具有优势。

由于人血清中抗体混杂，若同时加入荧光剂标记的二抗，容易在层析试纸条上产生非特异结合，并造成勾状效应，缩短测量范围，造成结果判读不准［9］，这些现象在本研究采用一步法检测PLA2RIgG时也存在。为解决上述问题，本方法采用两步法加液，将样本与示踪微球先后加入样品垫，令待测物与NC膜中的靶抗原充分反应，使得再加入的微球二抗能更精准的捕获T线上的一抗，进而形成目标免疫复合物。本研究首次通过二步法反应，提高了试纸条免疫反应的充分性，提升了标记抗体的靶向性，增加了反应灵敏度和测量范围。本方法总孵育时间20 min，较常规ICA的15 min［10］适当延长，但与ELISA相比仍具有时间优势。

床旁检测价格低廉、操作便捷、即时高效，不使用复杂的仪器，也不需要专业的检验人员，因此特别适合于迅速指导临床治疗，在单人次临床检测中发挥越来越大的作用［11-13］。ICA为床旁检测的最常见形式，广泛用于医学检测、治疗监测、食品安全等领域［13-16］。ICA常采用胶体金示踪，根据颜色的深浅判断结果，只能定性和半定量检测。而通过前期研究可知：镧系元素的激发光波长范围较宽，发射峰范围窄，本底荧光强度低，有助于提高检测灵敏度［17-19］，将镧系元素与ICA融合将大幅度地提高检测的灵敏度和特异性，实现ICA的全定量检测［20-21］。本研究使用含Eu的微球作为示踪物，用微球将Eu包裹其中，使后者与水相隔离，避免了荧光猝灭，也无需使用增强液等信号放大试剂，从而进一步提高了反应效率和便捷度，并且在已构建的夹心法的基础上［20］，拓展了镧系元素ICA的反应类型，再次证明间接法在该检测体系上的可行性。

然而ICA受层析介质的影响，不同厂家的硝酸纤维素膜、吸水纸都可能产生不同的层析效果，而且试纸条长短也会影响免疫反应［22］。本方法仅针对杰一公司提供的试纸条原材料，在6 cm试纸条上进行了PLA2R-IgG检测研究，其他长度和厂家的试纸条是否适用于本指标检测有待进一步考量。

4 结 论

本文基于首创的两步法反应和Eu荧光微球示踪的免疫层析技术，实现了即时、定量、灵敏、准确检测人血清中PLA2R-IgG。与市售ELISA试剂相比，本方法具有单人份和随到随测的优势，具有普及推广前景。