YAP在非贲门胃癌的表达及其基因多态性与YAP表达水平的关系

马立聪，田旭阳，刘得利，白雪峰，贾彦彬2,,5

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均位居所有恶性肿瘤的前列[1]。我国是胃癌的高发地区，据统计，2018年我国新增胃癌病例45.6万例，因胃癌死亡病例39万例[2]，严重影响人民的生命健康。Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)是Hippo肿瘤抑制通路中的主要效应因子[3]，去磷酸化的YAP能够在细胞核中作为转录共调节因子诱导一些基因的转录和表达，调控细胞的增殖、凋亡、分化，进而调控组织稳定和器官生长[4]。目前，国内外有关YAP基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)与其蛋白表达水平的关系未见报道。该研究采用免疫组织化学SP法检测YAP蛋白在非贲门胃癌组织和癌旁正常胃组织中的表达差异，分析YAP蛋白表达水平与临床病理特征的关系，并首次研究了YAP基因SNP与其蛋白表达水平之间的关系，初步探讨YAP与非贲门胃癌发生发展的关系，为胃癌的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象病例组为2008—2011年包头市肿瘤医院经病理学确诊的非贲门胃癌病例126例，所有病例均为汉族，且三代无与其他民族通婚史，发病时已在包头市居住5年以上的原发病例，且未接受过化疗和放疗。其中104例为手术根治标本，同时留取了距肿物≥5 cm的正常胃组织。其余22例为胃镜下咬钳组织，无正常对照。所有癌组织和正常胃组织均经高年资病理医师在显微镜下确认。所有病例均留取2 ml外周血，并提供知情同意书，本课题已获包头医学院医学伦理委员会批准。

1.2 YAP蛋白表达水平检测采用免疫组织化学SP法检测126例非贲门胃癌组织和104例癌旁正常组织中YAP蛋白的表达水平。SP试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，YAP一抗购自艾博抗(上海)贸易有限公司。将非贲门胃癌组织及癌旁正常组织进行石蜡切片，切片厚3 μm，烤片2 h，然后依次用二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱二甲苯，水洗，柠檬酸高温高压修复，PBS缓冲液洗脱，一抗4 ℃孵育过夜，PSB缓冲液洗脱，二抗孵育0.5 h，DAB显色，显微镜下观察染色结果。所有免疫组化染色结果均由2位高年资病理医师采用双盲法判定，每张切片随机选取5个视野，以胞核和胞质中出现背景清晰的棕黄色颗粒作为阳性结果，由阳性细胞百分比和阳性强度共同决定其表达水平。阳性细胞百分比：≤5%为0分，>5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分；阳性强度：阴性为0分，弱阳性为1分，中度阳性为2分，强阳性为3分。阳性细胞百分比与阳性强度评分乘积≥1分则认为YAP呈阳性表达。

1.3 SNP的筛选根据Hapmap数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的中国汉族人群多态性数据，在YAP基因进行了标记单核苷酸多态性(Tag-SNP)的筛选，要求最小等位基因频率(minimum allele frequency，MAF)>0.05，连锁不平衡相关系数(r2)>0.8。根据文献报道的可能与疾病相关的SNP[5-6]，优先选择了rs11225163和rs1820453两个多态性位点进行分析。

1.4 SNP的分型采用外周血DNA提取试剂盒提取126例样本外周血白细胞DNA，试剂盒购自北京天根生化科技(北京)有限公司。采用Taqman探针法对126例样本进行基因分型，基因分型在北京赛默百合生物科技有限公司完成。实验中设阴性对照和阳性对照，基因分型没有成功的样本不再进行重复实验。实验中随机选取5%DNA质量和数量较好的样本进行重复实验，以验证结果的准确性。经检测，所有重复样本基因分型结果的一致性为100%。

1.5 统计学处理采用R软件(version3.5.0;http://www.r-project.org)进行统计分析，采用χ2检验或Fisher确切概率法分析病例组和对照组中YAP蛋白表达水平的差异以及YAP蛋白表达水平与年龄、性别、肿瘤分化程度、淋巴结转移情况以及肿瘤大小等临床病理特征之间的关系，P<0.05为差异有统计学意义。采用非条件性Logistic回归法计算经年龄、性别调整后的比值比(odds ration，OR)值以及95%置信区间(confidence intervals,CI)，用以评估两个SNP在共显性、显性、超显性、隐性和附加5种遗传模式下与YAP蛋白表达水平之间的关联性，采用Haploview 4.2软件构建单体型，并分析单体型与YAP蛋白表达水平的关联性。

2 结果

2.1 YAP蛋白在126例非贲门胃癌组织和104例癌旁正常组织中的表达情况在126例非贲门胃癌组织中，YAP蛋白表达阴性者16例(12.7%)，阳性者110例(87.3%)，其中，评分1分者37例，2分者40例，3分者33例。在104例癌旁正常组织中，YAP蛋白表达阴性者57例(54.8%)，阳性者47例(45.2%)，其中，评分1分者35例，2分者11例，3分者1例。统计分析得出，YAP蛋白在非贲门胃癌组织中的表达水平高于其在癌旁正常组织中的表达水平，差异有统计学意义(χ2=46.630，P<0.001)，见图1。

图1 YAP蛋白在非贲门胃癌组织及癌旁正常组织中的表达情况 ×100

2.2 YAP蛋白表达与临床病理特征的关系YAP蛋白表达水平与肿瘤分化程度呈负相关(P<0.05)，与性别、年龄、淋巴结转移及肿瘤大小无关联(P>0.05)，见表1。

2.3YAP基因多态性与其蛋白表达水平的关联性统计结果显示，SNP rs11225163和rs1820453在共显性、显性、超显性、隐性和附加5种遗传模式下与YAP蛋白表达水平之间无关联，见表2。

表2 5种遗传模型下SNP rs11225163、rs1820453与YAP蛋白表达的关联性

2.4YAP单体型与蛋白表达水平的关联性使用Haploview 4.2软件对所研究的SNP进行连锁不平衡检验，计算LOD值、连锁不平衡系数D′，采用D′置信区间法构建单体型。结果显示，所研究的YAP基因2个SNP位点之间未构成单体型块。

3 讨论

YAP是Hippo肿瘤抑制通路中的核心组件，被证实在肺癌、乳腺癌、大肠癌等多种恶性肿瘤中的表达水平显著升高[7-9]。此外，韩新影 等[10]发现，YAP蛋白在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)。Yan et al[11]同样在其研究中发现，YAP蛋白在人胃癌细胞系AGS中的表达水平显著高于正常胃黏膜细胞，提示YAP可能参与了胃癌的发展。但所有相关研究均未对胃癌的组织学类型进行分类，这可能对研究结果造成偏倚。胃癌分为贲门癌和非贲门癌两类，贲门癌在流行病学、临床病理特征及分子生物学特征等方面与食管癌相近，因此，为了保持研究样本的均质性，本研究将病例限定为非贲门胃癌。

本研究结果显示，YAP蛋白在非贲门癌组织中的表达水平较正常胃组织显著升高，差异有统计学意义(P<0.001)，与上述学者相关研究结果相符，说明YAP可能参与了非贲门胃癌的发病过程。Han et al[12]在其研究中发现，YAP蛋白在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常胃组织，并且与年龄、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期等临床病理特征呈正相关。本研究同样分析了YAP蛋白表达水平与临床病理特征之间的关系，发现其表达水平与肿瘤分化程度呈正相关(P<0.05)，与Han et al[12]的研究结果一致。这一结果刚好证实了YAP具有调节细胞分化程度的生物学功能[13-14]，肿瘤细胞分化程度越低提示患者预后越差，换言之，可以推测YAP在非贲门胃癌组织中的表达水平越高，患者的预后越差，YAP蛋白表达水平或许可能成为判断非贲门胃癌患者预后的指标。

本研究并未发现YAP蛋白表达与性别、年龄、淋巴结转移和肿瘤大小存在关联，与Han et al[12]的研究结果不符，出现这一结果的原因可能有：第一，本研究将胃癌类型限定为非贲门胃癌，而Han et al[12]的研究并未区分贲门癌与非贲门癌，YAP蛋白在非贲门胃癌组织中的表达水平可能不受性别、年龄、淋巴结转移和肿瘤大小等因素的影响；第二，可能与本研究纳入的样本量较小有关，因此本研究结果还需进一步证实。

YAP蛋白由YAP基因所编码，该基因位于人类常染色体11q22.1[15]。本研究选择了YAP基因中rs11225163和rs1820453这两个SNP进行研究，其中rs11225163位于内含子区域，被发现与黑色素瘤患者的存活率相关[5]，与携带CT+TT基因型比较，携带CC基因型患者存活率降低[CCvs.CT+TT:HR=1.79,95%CI=1.18～2.72,P=0.007]。rs1820453位于可变区上游2 kb，Chen et al[6]的研究发现，rs1820453与中国妇女乳腺癌的发病相关，与携带AA基因型的人比较，携带CC基因型的人患乳腺癌的风险显着增加(OR=2.05，95%CI=1.19～3.53，P= 0.009)。上述研究并未探讨疾病的发生是否是由于两个SNP引起蛋白表达的改变从而致病，或研究的SNP是否与其他已知致病SNP之间存在强连锁不平衡而与疾病的发生发展关联。