利用活细胞工作站构建巨噬细胞吞噬子宫内膜癌细胞的体外模型

檀学文，陈维乐，陈义昭，方亦龙，蒋海峰，许 振，涂佳杰，魏 伟

巨噬细胞是固有免疫系统中的重要细胞，与肿瘤发病密切相关[1-2]。活细胞工作站及其自带的培养系统，能模拟活细胞的生活环境，是一种体外研究细胞行为的重要方法[3-5]。目前流式细胞术被广泛用于检测最终的细胞吞噬比例，但不能体现动态吞噬过程[6]。巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的过程是肿瘤微环境中一种复杂的相互作用[7]，利用活细胞工作站直接记录巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的动态过程有助于进一步研究这一复杂过程，并且能够继续探讨巨噬细胞吞噬肿瘤细胞后对CD8+IFNγ+细胞毒性T细胞激活的影响。该研究利用活细胞工作站，建立了巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的体外模型，这为深入研究巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的动态过程提供了一种可靠的实验方法，同时研究巨噬细胞吞噬肿瘤细胞后增强T细胞的抗原提呈作用，证实其能活化细胞毒性T细胞对肿瘤的杀伤作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株人源单核细胞系THP-1和人源子宫内膜癌细胞系Ishikawa购自武汉普诺赛公司。

1.2 试剂与仪器DMEM无酚红高糖培养基、RPMI 1640培养基、MEM培养基、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)、胎牛血清购自以色列BI公司；胰蛋白酶、青-链霉素溶液购自上海碧云天生物技术有限公司；非必需氨基酸购自美国Gibco公司；荧光染料CFSE购自上海贝博生物科技有限公司；Brilliant Violet 421 anti-human CD11b、Brilliant Violet 421 anti-human CD8、PE/Cy7 anti-human IFNγ、PE anti-human CD3购自美国Biolegend公司；ProLongTMLive Antifade Reagent购自美国ThermoFisher公司；人源淋巴细胞分离液购自北京达科为生物技术有限公司；玻璃底成像皿购自北京兰杰柯科技有限公司；徕卡活细胞工作站DMi8购自德国Leica公司；SIGMA 3-30 K低温高速离心机购自上海纳腾仪器有限公司；流式细胞仪购自美国Beckman公司。

1.3 细胞培养THP-1细胞培养于RPMI 1640培养基中，另补加10%胎牛血清和1%的青-链霉素，Ishikawa细胞培养于MEM培养基中，另补加5%胎牛血清、1%的青-链霉素和1%非必需氨基酸置于37 ℃，5% CO2的培养箱中常规培养。当细胞密度长至80%左右时开始后续实验。

1.4 活细胞工作站细胞样本制备以5×105个/ml的密度将THP-1细胞接种于12孔板中，每孔1 ml完全培养基和100 ng/ml佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)，处理48 h后换成普通完全培养基继续培养24 h。THP-1预处理72 h后用0.25%胰蛋白酶消化制备成细胞悬液，再用PBS洗涤细胞2次后加入100 μl PBS重悬，在4 ℃条件下用抗人CD11b孵育巨噬细胞30 min，PBS洗涤后用500 μl不含酚红DMEM完全培养基重悬。将细胞密度1.5×105个/ml Ishikawa细胞从培养瓶中消化并用含CFSE荧光探针的染色工作液重悬，在37 ℃培养箱孵育20 min后离心收集细胞，PBS洗涤细胞2次后用500 μl不含酚红DMEM完全培养基重悬备用。将上述处理的CD11b标记THP-1细胞与CFSE标记Ishikawa细胞在37 ℃、5% CO2湿润环境按约3︰1的比例混合接种在玻璃底成像皿中。

1.5 成像观察预先开启活细胞工作站自带微型培养箱保持37 ℃、5% CO2的细胞培养环境，设置活细胞工作站成像系统拍摄参数：激发光强度为3，绿色荧光曝光时间为100 ms，蓝色荧光曝光时间为30 ms，FIM为50%，IL-FId为6。将接种2种细胞的玻璃底成像皿放置37 ℃、5% CO2的微型培养箱中，在活细胞工作站成像系统下，每5 min拍摄一张照片，拍摄120 min，挑选巨噬细胞吞噬Ishikawa细胞的代表图。

1.6 流式细胞术检测CD8+IFNγ+T细胞THP-1诱导的巨噬细胞与Ishikawa细胞混合共培养24 h后，加入人外周血PBMC继续共培养24 h，流式细胞术检测CD3+CD8+IFNγ+T细胞数量。

1.7 统计学处理采用GraphPad Prism 8.2.1软件进行统计分析和作图，结果以均数±标准误差(Mean±SEM)表示，组间比较采用t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 THP-1诱导的巨噬细胞和Ishikawa细胞的荧光标记THP-1给予PMA诱导的巨噬细胞和Ishikawa细胞分别用Brilliant Violet 421-CD11b和CFSE荧光探针进行标记，其中蓝色荧光标记的是THP-1诱导的巨噬细胞，绿色荧光标记的是Ishikawa细胞。见图1。

图1 THP-1诱导的巨噬细胞和Ishikawa细胞的荧光标记图

2.2 活细胞工作站记录THP-1诱导的巨噬细胞吞噬Ishikawa细胞的过程活细胞工作站实时拍照记录巨噬细胞对Ishikawa细胞的逐步吞噬情况，在120 min内每隔5 min拍摄一张照片，记录巨噬细胞吞噬Ishikawa细胞的过程并整理出每隔15 min的全视野细胞吞噬图像(图2A)。在整个视野中均可以观察到THP-1诱导的巨噬细胞围绕Ishikawa细胞不停运动，并随着共培养时间的增加，巨噬细胞逐渐吞噬Ishikawa细胞。活细胞工作站拍摄的照片记录着整个拍摄视野中的不同位置，每个位置上均匀分布着巨噬细胞和Ishikawa细胞，巨噬细胞识别周围的Ishikawa细胞，不断摄取Ishikawa细胞的绿色荧光，Ishikawa细胞的绿色荧光逐渐到被巨噬细胞的蓝色荧光包裹，形成蓝色荧光环绕绿色荧光的类似同心圆结构。在图2B、C中，可以清楚呈现出巨噬细胞对Ishikawa细胞的吞噬现象。在共培养的不同时间点，可见到巨噬细胞开始吞噬Ishikawa细胞。图2B中，巨噬细胞对Ishikawa细胞的吞噬作用发生在共培养40 min，巨噬细胞开始逐步摄取Ishikawa细胞的绿色荧光。图2C展现了巨噬细胞在80 min时开始吞噬Ishikawa细胞。随着吞噬作用的不断进行，Ishikawa细胞的绿色荧光逐渐减弱，与0 min比较，120 min后绿色荧光减弱，差异有统计学意义(t=5.692,P<0.05)，结果见图2D。

图2 THP-1诱导的巨噬细胞吞噬人子宫内膜癌Ishikawa细胞示意图

2.3 巨噬细胞对多个Ishikawa细胞的吞噬情况在巨噬细胞和Ishikawa细胞同培养0 min时，活细胞工作站记录Ishikawa细胞和巨噬细胞呈现独立分布。与Ishikawa细胞比较，巨噬细胞的比例更高，巨噬细胞均匀分布在Ishikawa细胞周围。巨噬细胞吞噬单个Ishikawa细胞后，迁移到另一个Ishikawa细胞旁，不断摄取其绿色荧光直至绿色荧光被巨噬细胞的蓝色荧光完全包裹。在40 min时，吞噬了Ishikawa细胞的巨噬细胞开始包围摄取另一个Ishikawa细胞的绿色荧光，并在80 min时完全包裹Ishikawa细胞，表明随着共培养时间的延长，单个巨噬细胞能够吞噬多个Ishikawa细胞。见图3。

图3 巨噬细胞吞噬多个Ishikawa细胞的示意图 ×25

2.4 流式细胞术检测巨噬细胞吞噬Ishikawa细胞后对T细胞的影响为了观察巨噬细胞吞噬Ishikawa细胞后对T细胞的作用，利用流式细胞术检测T细胞比例。与未吞噬Ishikawa细胞的巨噬细胞与PBMC共培养组比较，吞噬了Ishikawa细胞的巨噬细胞与PBMC共培养组中CD3+CD8+IFNγ+T细胞数量显著增加，差异有统计学意义(t=9.876,P<0.05)，表明巨噬细胞吞噬Ishikawa细胞后促进CD3+T细胞转变为CD8+IFNγ+细胞毒性T细胞，增强T细胞对Ishikawa细胞的杀伤作用。见图4。

图4 流式细胞术检测巨噬细胞吞噬Ishikawa细胞后对T细胞的影响

3 讨论

巨噬细胞是人体免疫系统的重要细胞，能够摄取并且清除肿瘤细胞[8-9]，同时T细胞能够识别巨噬细胞提呈的肿瘤抗原信息，杀伤肿瘤细胞[10]。本研究选择THP-1诱导的巨噬细胞和子宫内膜癌Ishikawa细胞进行共培养，运用活细胞工作站构建了体外巨噬细胞对Ishikawa细胞的吞噬模型，为研究巨噬细胞对肿瘤细胞的动态吞噬过程提供一种新的方法。同时观察巨噬细胞吞噬Ishikawa细胞的后续过程，实验结果证实CD8+IFNγ+细胞毒性T细胞被进一步活化。

长时间观察巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的复杂动态过程，这是既往使用的流式细胞术和普通荧光显微镜无法实现的，但是活细胞工作站能够实现。从实验结果可以看出，使用活细胞工作站观察巨噬细胞吞噬肿瘤细胞有几个比较重要的条件：① 活细胞工作站必须配有微型培养箱，保证细胞在成像观察过程中保持正常的健康状态；② 用100 ng/ml PMA将THP-1诱导成具有强大吞噬能力的巨噬细胞；③ 对巨噬细胞和肿瘤细胞进行不同的荧光标记，以便在动态过程中区分两种不同的细胞，本研究使用Brilliant Violet 421-CD11b和CFSE荧光探针，分别标记THP-1诱导的巨噬细胞和Ishikawa细胞，其中CD11b标记巨噬细胞膜表面，在吞噬过程中能够明显观察到Ishikawa细胞的绿色荧光被摄取到巨噬细胞胞质内。

观察时间过长可能因为光漂白导致荧光逐渐淬灭，影响成像质量，这是活细胞成像重要的局限性。在本研究中为了减少荧光淬灭，将成像系统的参数进行调整，降低激发光强度，调整FIM为50%，并使用活细胞抗荧光淬灭剂，结果在成像过程中减少了荧光淬灭。

综上所述，活细胞工作站能够实时记录巨噬细胞吞噬肿瘤细胞，长时间动态观察细胞吞噬过程，弥补经典流式细胞术和荧光显微镜的不足，为巨噬细胞与肿瘤细胞相互作用研究提供了一种可行的实验方法。在此基础上，通过流式证明了巨噬细胞吞噬肿瘤细胞后能够增加CD8+IFNγ+细胞毒性T细胞的比例，发挥T细胞的抗肿瘤作用。本研究中所演示的肿瘤细胞-巨噬细胞-T细胞3种细胞的相互作用模型为体外水平研究肿瘤免疫治疗作用及相关潜在靶点开发提供了一个的理想平台。